超高效液相色谱在香蕉皮多酚物质提取分离中的应用

陆 嫣

(梧州学院 化学工程与资源再利用学院，广西 梧州 543002)

香蕉富含多种有机酸、蛋白质、油脂类、糖类、维生素以及多种酚类，同时还含有丰富的K，Ca，Mg等金属元素，上述各类营养物质成为香蕉加工企业的重要副产品，有较高的营养价值和保健功能[1]。尤其是香蕉皮所含的多酚，抗氧化作用较强，具有良好的抗衰老、抗癌、抗炎、抗过敏、抑制胆固醇上升等功能，被广泛地应用于化妆品、医药、食品、保健品等行业[2-3]。通常香蕉皮质量约占整个果实质量的1/3，人们在食用香蕉时往往将皮当做垃圾处理，不仅造成了环境污染，同时还浪费了资源。随着近年来香蕉皮产业和加工技术的发展，香蕉皮中的有用成分，如多酚，被提取利用。香蕉皮中多酚组分的提取使香蕉皮变废为宝，还有利于新药物的研发，节约了资源[4]。

目前，关于植物中多酚提取的方法有很多，如溶剂提取法、超声波辅助提取法、生物酶解提取法、超临界流体萃取法、膜技术提取法、离子沉淀法等[5]。而常用的多酚测定方法有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法。不同测定方法各有利弊，如薄层色谱法和紫外分光光度法仅能测定单一多酚或者多酚的总量，无法测定多酚的具体种类以及相应含量[6-7]。鉴于此，本研究选择超高效液相色谱(UPLC)法来测定香蕉皮的多酚组分，该方法不仅准确度高，还有很好的重复性，同时操作非常简便，可以同时对植物中的多种多酚进行测定[8]。

1 超高效液相色谱

超高效液相色谱(UPLC)是分离科学中产生的一个新领域，但其使用原理和理论与高效液相色谱基本相同。它不仅包含了低系统体积、小颗粒填料、快速检测手段等全新的技术，还加入了色谱峰容量、分析通量、灵敏度等。因此，超高效液相色谱可以依据离子交换、分配、筛析、吸附、亲和等原理进行分离样品[9]。目前使用较多的是UPLC-PDA分离检测法，特别是在黄酮类、儿茶素类等组分分离检测中。另外，基于1.7μm小颗粒技术的UPLC虽然与常用的HPLC的分离原理基本相同，但是前者具有更强的分离能力，可满足人们对分离速度和分离度的要求，可以在很快的流速和线速度以及反压情况下完成高效分离。其优点主要有以下方面。

(1)超高分离度。基于1.7μm颗粒使用，其提供的柱效更为高效，是5μm颗粒的3倍以上，并且因为颗粒变小，分离度显著增加，在梯度分离中也是如此，同样具有明显的优越性，即分离能力增大，峰容量增加，可以分离出更多的色谱峰，从而使人们对样品的认识水平到达新的高度，同时还缩短了产品开发时间。

(2)超高速度。因为系统采用的颗粒只有5μm的1/3，所以在柱效保持不变的情况下，色谱柱长度可以缩短1/3，而分离速度则可以增大约3倍，实现了分离度不变而分离时间缩短，这使得整个分析过程变得更加高效。

(3)超高灵敏度。因为小颗粒技术的使用，改变了以往色谱柱的柱效，大大改善了分离度以及相对较窄的色谱峰宽度，即具有高灵敏度。得益于此，峰宽较窄，会相应地增加峰高，在快速分析过程中，峰高越明显，越便于研究者分析。与HPLC相比，UPLC技术可以在提高分离度的同时，进一步增加分离的灵敏度。所以，UPLC法可以用于研究植物中多酚以及类胡萝卜素等物质的分离检测。综上所述，UPLC的高灵敏度和分离效果非常适合香蕉皮中多酚物质的提取分离，本试验采用UPLC完成研究工作。

2 超高效液相色谱在香蕉皮多酚物质提取分离中的应用

香蕉汁液成分非常复杂，而且目标对象的含量又较低，一般情况下，样品制备中提取率通常比较低，而且操作繁琐，需要耗费大量的溶剂。尤其是在香蕉皮等果皮中，多酚物质含量本来较低，提取非常困难，即使能提取，效率也极其低下，严重影响了测定工作。所以，如何能快速准确地测定香蕉皮中多酚物质的含量对其综合利用有着很重要的现实意义和经济意义[10-11]。而超高效液相色谱则刚好能够解决上述问题，其高效分离和高灵敏度在香蕉皮多酚组分提取中得到了广泛的应用。

试验仪器与材料：湖南赫西TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机，上海亚荣RE-2000A旋转蒸发器，美国华志HZY-B电子天平，上海析达HH-2恒温水浴锅，Waters alliance_acquity e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；鲜香蕉皮(本地产)，无水乙醇(沪试 分析纯)，蒸馏水、甲酸(沪试 色谱纯)，甲醇(沪试 色谱纯)。

2.1 香蕉皮多酚物质的提取分离

现阶段，植物多酚的提取分离工艺方法较多，各有利弊，目前有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波浸提法和微波浸提法等，本研究选用操作简单易行的溶剂萃取法[12-13]。选用无毒型溶剂——乙醇作为萃取剂。

2.1.1 试验设计和试验结果。有研究表明该溶剂萃取过程受乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间、料液比等条件的影响，通过正交试验方法，以乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比为考察的4个因素，每个因素设3水平。以多酚提取率为指标，采用L9(34)正交试验设计(见表1)，得出最佳浸提条件。

表1 香蕉皮多酚提取分离正交试验设计

试验结果显示，影响浸提效果的因素影响大小为乙醇体积分数>提取温度>提取时间>料液比。得到香蕉皮多酚的最佳提取方案为提取溶剂为80%乙醇、料液比1∶4(g∶mL)、提取温度为80℃、提取时间120 min。

2.1.2 最佳提取工艺的确定。根据试验结果，确定最佳提取工艺如下：称取10 g香蕉皮，切片、沸水中浸泡5 min，以钝化多酚氧化酶的活性，香蕉皮破碎均质，用40 g体积分数为80%的乙醇水溶液浸提，80℃水浴条件下不断搅拌，持续120 min，然后过滤合并滤液，离心，减压蒸馏滤液回收乙醇，冷却得香蕉皮中的多酚物质。

2.2 超高效液相色谱的测试条件

因为香蕉皮的成分复杂，影响其多酚物质分离的因素也较多，所以在进行色谱分离之前需要对测试条件进行优化处理。如张晋芬等[14]人在研究和测定香蕉、梨以及苹果中8种多酚物质时，为了避免由于干扰和影响而产生较大的误差，对色谱进行相应的处理，进行色谱优化。

2.2.1 洗脱梯度。考虑到各组分极性差别较大，等度洗脱无法满足本次试验要求，在多次试验的基础上设定：0～20 min(5%～70%)，以满足样品中各组分能够达到基准线。

2.2.2 检测波长的确定。根据文献研究结果，多酚物质在吸光度为190～400 nm时，且在波长为280 nm处达到最大吸光度，因此设定检测波长为280 nm。

2.2.3 流动相流速。分别将流速定为0.6，0.8，1.0 mL/min，试验发现当流速为0.8 mL/min时具有最好的出峰效果。

2.2.4 配制样品溶液时采用的甲醇含量。因为试验采取的是梯度洗脱，甲醇溶剂在流动相里的变化非常大，往往会导致拖尾峰或者前延峰等问题。研究发现，在样品溶液中甲醇的含量为30%时，可以减弱这种现象，从而得到良好的效果。并在此色谱条件下进行对比研究，对照品和样品色谱见图1。

a.没食子酸；b.原儿茶酸；c.儿茶素；d.绿原酸；e.表儿茶素；f.咖啡酸；g.阿魏酸；h.芦丁

试验结果显示，在此条件下，8种多酚物质可以达到较好的分离效果，故本研究在测试之前，通过对上述影响因素进行分析，确定本研究的最优色谱条件如下[15]：PDA检测器，检测波长280 nm，进样量2 μL，进样温度15℃，柱温35℃，流速0.45 ml/min，色谱柱Acquityuplcbeh C182.1mm×50.0mm，1.7μm，流动相为A.甲醇，B.甲酸(0.2%)。梯度洗脱程序：0～1 min：甲醇∶甲酸(10%∶90%)；1～3 min：甲醇∶甲酸(20%∶80%)；3～5 min：甲醇∶甲酸(50%∶50%)5～7.5 min：甲醇∶甲酸(30%∶70%)7.5～10 min：甲醇∶甲酸(10%∶90%)。按照上述的试验方法和条件，分别测定了16种多酚物质的响应特性，并求得标准曲线，结果见表2。

表2 多种酚的标准曲线及最低检出限

在此条件下各类多酚标准品在高效液相色谱中液取得较好的分离效果，见图2、图3。

a.没食子酸；b.四羟基苯甲酸；c.儿茶素；d.咖啡酸；e.表儿茶；f.芦丁；g.根皮苷；h.反式肉桂酸；i.根皮素

j.二轻基苯甲酸；k.绿原酸；l.丁香酸；m.对香豆素；n.阿魏酸；o.鞋花酸；p.懈皮素

3.3 分析结果

对以上提取的香蕉皮多酚进行超高效液相色谱分析，结果见图4。

结果确认并检测到提取液中11种多酚物质(见图4)。其含量如下：儿茶素.0.435 mg/g；表儿茶.1.027 mg/g；芦丁.0.674 mg/g；绿原酸.1.345 mg/g；咖啡酸.0.320 mg/g；丁香酸.0.238 mg/g；对香豆酸.0.149 mg/g；阿魏酸.0.260 mg/g；二羟基苯甲酸.0.341 mg/g；反式肉桂酸.0.026 mg/g；根皮素.0.014 mg/g。

c.儿茶素；d.咖啡酸；e.表儿茶；f.芦丁；h.反式肉桂酸；i.根皮素；j.二轻基苯甲酸；k.绿原酸；l.丁香酸；m.对香豆素；n.阿魏酸

3 结论

香蕉富含的多酚有较强的抗氧化作用，具有较高的药用价值。香蕉多酚现有多种提取分离工艺和分析方法，如SP法、FL法、TLC法等，这些方法设备简单，操作方便，但是都不能对化学物质进行精确的定性定量，往往测定的是一类化合物的总量，并且无法消除杂质干扰，无法满足对多种物质的分离和精确检测。超高效液相色谱(UPLC)在香蕉皮中多酚物质提取分离中的检测应用，前处理简单，检测速度快，适合检测香蕉中大多数活性成分。对于多酚等物质分离效果好，灵敏度高，但是测试时需根据自身要求优化检测条件。本研究在优化的测试条件下，使香蕉皮中多酚物质得到较好的分离，确认并检测到提取液中11种多酚物质，其含量分别为儿茶素.0.435 mg/g；表儿茶.1.027 mg/g；芦丁.0.674 mg/g；绿原酸.1.345 mg/g；咖啡酸.0.320 mg/g；丁香酸.0.238 mg/g；对香豆酸.0.149 mg/g；阿魏酸.0.260 mg/g；二羟基苯甲酸.0.341 mg/g；反式肉桂酸.0.026 mg/g；根皮素.0.014 mg/g。