川芎嗪对长期注射水杨酸钠耳毒性拮抗作用的研究△

苏俊 张云美 王梗伊 陈琪 张洁静 朱舒明

水杨酸钠(sodium salicylate, SS)在临床上普遍用于解热镇痛和抗炎、预防心肌梗塞、心绞痛以及中风等。耳毒性是水杨酸钠最常见的不良反应，现已证明，大剂量水杨酸钠是听力损失和耳鸣的可能诱因，但其药物的慢性和急性作用机制还不完全清楚[1]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是从川芎中提取的一种生物碱单体: 4-甲基吡嗪，川芎具有抑制自由基产生、提高内源性超氧化物歧化酶活性、清除自由基、改善血液流变学、抗脂质过氧化等药理作用[2]，王晨露等[3]研究发现川芎嗪能有效防护庆大霉素的耳毒性损伤。本研究拟通过观察长期注射水杨酸钠致大鼠听损伤，并应用川芎嗪加以拮抗，探讨中药川芎嗪对长期注射水杨酸钠致听损伤耳毒性的拮抗效果。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组 雄性SPF级SD大鼠50只(8周龄，体重180～200 g，浙江中医药大学动物实验中心提供)，耳廓反射灵敏，无强噪声暴露及耳毒性药物使用史，适应性喂养一周后，采用随机数字表法分为生理盐水对照组(saline control group，SC组)16只、水杨酸钠组(SS组)17只，川芎嗪治疗组(TMP+SS组)17只；所有大鼠均在屏蔽环境内饲养，每笼饲养4～5只，温度22±2 ℃，湿度50%～60%，光照每12 h明暗交替，换风次数15～20次/小时，自由进食标准饲料和水，环境噪声小于40 dB A。

1.2各组大鼠给药剂量及方法 SC组：腹腔注射生理盐水2.5 ml/kg，每天一次，连续14天；SS组：水杨酸钠用生理盐水配置，浓度为50 mg/ml，按400 mg/kg腹腔注射，每天一次，连续14天；TMP+SS组：先腹腔注射400 mg/kg水杨酸钠溶液后，立即于对侧腹腔注射40 mg/kg盐酸川芎嗪溶液，每天一次，连续14天。每天注射前各组动物称体重并记录。

1.3畸变产物耳声发射(DPOAE)检测 各组动物完成给药后于第15天进行DPOAE检测，检测仪器为校准过的Smart OAE耳声发射仪。大鼠经8%水合氯醛40 mg/kg麻醉后，在环境噪声<30 dB A的隔声屏蔽室内进行检测。两个纯音的初始强度为L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，f2/f1=1.22，记录f2频率为1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz时2f1-f2处的DPOAE反应幅值。

1.4听性脑干反应(ABR)测试 各组动物完成给药后于第15天进行ABR检测，检测仪器为校准过的GSI Audera听觉诱发电位仪。大鼠经8%水合氯醛40 mg/kg麻醉后，在环境噪声<30 dB A的隔声屏蔽室内进行检测。记录电极置于两侧外耳道口与颅正中线交叉处皮下，参考电极位于同侧耳后乳突皮下，接地电极置于鼻尖正中皮下，刺激声为短声，插入式耳机单侧给声，刺激速率为21.1次/秒，带通滤波0.1～3 kHz，叠加次数2 048次，扫描时间为10 ms，测试声强由80 dB nHL开始，以5 dB递减，以波Ⅱ最后消失的上一强度作为反应阈，记录双耳ABR阈值和潜伏期。

1.5统计学方法 用SPSS 21.0软件对各组数据进行统计分析，采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组大鼠用药后的体重变化 在连续用药14天后，SS组和TMP+SS组大鼠精神萎靡、反应迟钝、毛色晦暗，且SS组尿量明显增多，TMP+SS组和SS组大鼠分别在注射后第9、12天各死亡1只。在连续用药第7天和14天，SS组、TMP+SS组与SC组相比体重明显减轻，差异有统计学意义(P<0.05)；SS组和TMP+SS组相比，体重差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各组SD大鼠用药后第1、7、14天体重比较(n=16只)

2.2各组用药后DPOAE幅值比较 在连续用药14天后，第15天，在f2为1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz时，SS组DPOAE幅值较SC组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；TMP+SS组与SC组相比，DPOAE幅值差异无统计学意义(P>0.05)；在f2为1 000、4 000、6 000 Hz时，SS组DPOAE幅值较TMP+SS组升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表2，图1)。

表2 各组SD大鼠1 000～6 000 Hz DPOAE幅值(dB SPL,

2.3用药后各组ABR反应阈及潜伏期比较 在连续用药14天后，第15天，SS组与SC组相比，ABR阈值升高，波Ⅱ潜伏期延长，差异有统计学意义(P<0.05)；TMP+SS组与SC组比较，波Ⅱ潜伏期延长，差异有统计学意义(P<0.05)；SS组与TMP+SS组波Ⅱ潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 各组ABR反应阈值(dB nHL)和波Ⅰ、Ⅱ潜伏期(ms)比较(n=32耳)

3 讨论

耳毒性是水杨酸钠最常见的不良反应，学者们一直在从听觉系统的各个层面研究水杨酸盐的毒副作用[4～6]。研究发现150 mg/kg或更高剂量的水杨酸钠可产生耳毒性不良反应[1]，因此本实验采用常见的长期腹腔注射水杨酸钠400 mg·kg-1·d-1的方法来制备大鼠长期注射水杨酸钠耳毒性动物模型。川芎嗪是中药川芎中提取的有效成分，其化学本质是一种钙通道阻滞剂，可调节钙离子在细胞内外的分布，从而保护血管内皮，改善缺血部位血液供应，减轻或逆转组织坏死状况[7]。石丽娟等[8]研究发现川芎嗪能拮抗链霉素的耳毒性；孙宪昌等[9]发现川芎嗪能拮抗顺铂的耳毒性；故本研究拟观察川芎嗪是否对水杨酸钠的耳毒性有拮抗作用。从文中结果看，与生理盐水对照组(SC组)相比，水杨酸钠组(SS组)和川芎嗪治疗组(TMP+SS组)出现体毛稀疏、活动量减少、反应迟钝、蜷缩群集、体重下降、尿量增多、大便稀等现象。在连续用药第7天和14天，SS组和TMP+SS组与SC组相比体重明显减轻(P<0.05)；SS组和TMP+SS组相比，体重差异无统计学意义(P>0.05)。说明长期注射水杨酸钠有明显的毒副作用，可造成大鼠体重明显减轻，且川芎嗪对水杨酸钠致体重减轻的拮抗作用不明显。

Huang等[10]研究发现急性注射水杨酸钠后豚鼠DPOAE幅值多呈可逆性降低，长期注射水杨酸钠使豚鼠DPOAE的幅值上升。本研究结果显示连续用药14天后，第15天在f2为1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz时，与SC组相比，SS组DPOAE幅值升高(P<0.05)，与Huang等[10]研究结果相同。说明水杨酸钠组SD大鼠出现了明显的耳毒性。此外，TMP+SS组与SC组相比，DPOAE幅值差异无统计学意义(P>0.05)；与TMP+SS组相比，在f2为1 000、4 000、6 000 Hz时SS组DPOAE幅值升高(P<0.05)，同时各频率DPOAE幅值均值SS组>TMP+SS组>SC组，说明川芎嗪对长期注射水杨酸钠耳毒性导致的DPOAE幅值升高有明显的拮抗作用，但不能完全扭转水杨酸钠的耳毒性。

最近的动物实验研究表明ABR可能作为一种客观的方法来揭示耳鸣引起的听觉系统的改变[11]。Lowe等[12]研究发现，在腹腔注射水杨酸钠250 mg/kg后3小时，ABR反应阈值平均增加21±1.6 dB，Castaeda等[11]研究发现口服水杨酸钠350 mg/kg 3天后，ABR阈值明显增高，而停药3天后ABR阈值恢复正常。在啮齿动物中，ABR波Ⅰ与听神经诱发的电位有关，而波Ⅱ～Ⅴ则与耳蜗核、上橄榄复合体、外侧丘系、下丘和内侧膝状体等中枢结构有关[13]。大鼠ABR波形和人类类似，但顺序不同，例如：大鼠的波Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别与人类的波Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ相匹配。本研究发现SD大鼠ABR的波Ⅱ幅值最高，且波Ⅱ的出现率最高也最稳定，与Castaeda等[11]研究相同，因此以波Ⅱ最后消失为阈值判定方法。本研究结果显示，持续用药14天后，第15天，与SC组相比，SS组ABR阈值升高(P<0.05),与Lowe[12]和Castaeda[11]研究相似，但他们的研究显示ABR反应阈增高明显，而本研究SS组ABR阈值升高幅度不如前者明显，原因可能为Lowe和Castaeda记录的为急性注射水杨酸钠引起的ABR阈值变化，而本研究记录的是长期注射水杨酸钠引起的ABR阈值变化。同时，本研究SS组与SC组相比，click声ABR波Ⅰ潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，波Ⅱ潜伏期延长，差异有统计学意义(P<0.05)；而Castaeda等[11]研究显示在8、16、24 kHz的短纯音刺激声下各波潜伏期缩短，而在click声和32 kHz短纯音刺激下，各波潜伏期延长，提示ABR各波潜伏期的差异取决于频率。本研究与Castaeda等[11]研究结果不同，提示急性注射水杨酸钠和长期注射水杨酸钠对ABR阈值和潜伏期的影响亦存在差异，需要进一步详细研究。本研究结果还显示，TMP+SS组与SC组相比，ABR阈值、波Ⅰ潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，波Ⅱ潜伏期延长(P<0.05)，提示川芎嗪对长期注射水杨酸钠导致的ABR反应阈值和潜伏期变化有一定的拮抗作用。

综上所述，川芎嗪对长期注射水杨酸钠耳毒性的拮抗作用相对较弱，能部分拮抗长期注射水杨酸钠引起的DPOAE幅值增高，但对其引起的ABR反应阈值和潜伏期改变的拮抗作用还需要进一步研究。