阿司匹林联合中药复聪汤对老年性聋小鼠耳蜗外毛细胞存活及prestin蛋白表达的影响△

武坤毅 李胜利 姬媛媛 樊小军 刘全征

阿司匹林(乙酰水杨酸)是重要的预防心脑血管疾病的药物[1]，大剂量的阿司匹林可以衰减庆大霉素的耳毒性[2,3]；有研究报道阿司匹林应用于62 261例女性未增加其听力损失发生率[4]。在噪声性聋研究方面，已证明阿司匹林可减少耳蜗自由基的产生[5]，可以抵抗噪声导致的耳蜗外毛细胞(outer hair cell,OHC)损失[6]；低剂量的阿司匹林可以延缓老年性聋的发展进程[7]。水杨酸在耳蜗的初期效应是下调外毛细胞膜的prestin蛋白活性从而导致听力损失，长期应用则上调prestin蛋白活性，增加其表达从而导致耳鸣发生[8]。水杨酸具有靶向性调控耳蜗外毛细胞prestin蛋白表达的作用[9]，成为耳聋耳鸣研究的热点。Chen等[10]报道老年性聋Fischer 344/NHsd小鼠耳蜗OHC prestin表达下降；本课题组前期研究证明老年性聋小鼠耳蜗OHC prestin的表达显著下降，表明prestin可能参与老年性聋的过程，可能是老年性聋的分子机制之一，可作为老年性聋早期预防和治疗的观察指标之一[11]。本课题组前期研究[12]证明200 mg的水杨酸长期慢性注射可以有效延缓老年性聋的发展进程，合适剂量的水杨酸可以上调耳蜗毛细胞prestin的表达，补偿因老年退化导致的prestin表达下降，使耳蜗顶部的毛细胞的损失减少，听功能下降明显减缓，但因对耳蜗底回的毛细胞损失影响不明显，故要进一步阻止老年性聋的发展，尚需联合其它方法进行更广泛和深入的研究。而本课题组前期应用中药复聪汤对耳毒性药物中毒和噪声性聋进行的实验研究已证明其可以促进损害的毛细胞修复和再生[12，13]，并且临床应用此药证明其对神经性耳聋患者的疗效显著[14]；本课题组运用该中药上调因老年退行性变导致的耳蜗外毛细胞prestin蛋白表达下调，取得较好的预防和治疗效果[15]。故本研究拟通过应用阿司匹林联合中药复聪汤对年龄相关性听力损失(age-related hearing loss, ARHL)DBA/2J小鼠进行治疗，探讨中西药联合应用对耳蜗外毛细胞prestin蛋白的表达及耳蜗毛细胞存活的影响，为老年性聋的预防及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用4周龄(W)DBA/2J近交系小鼠(南京模式动物研究所，品系编号J000671)120只，雌雄各半。随机分成6组，每组20只，分别为阿司匹林100 mg/kg加中药复聪汤治疗组、200 mg/kg阿司匹林加中药复聪汤治疗组、中药复聪汤治疗组、阿司匹林100 mg/kg治疗组、阿司匹林200 mg/kg治疗组及饮水对照组。

1.2治疗方法 阿司匹林肠溶片(国药准字H20065051,沈阳奥吉娜药业有限公司)药品配制：DBA/2J近交系小鼠4周龄平均体重15 g，每天平均每只小鼠饮水量为5 ml，动物按100 mg/kg的剂量每天摄入阿司匹林1.5 mg，每组20只小鼠总饮水量100 ml，总摄入阿司匹林30 mg；200 mg/kg组的剂量是前述阿斯匹林用量的一倍。100 mg/kg和200 mg/kg加中药复聪汤组，将阿司匹林肠溶片直接融入中药水剂中，单独100 mg/kg和200 mg/kg阿司匹林治疗组则用等量开水溶解。中药为山东菏泽康乐医院的复聪汤[14,15]，主要成分为桃仁、穿山甲、红花、川芎、黄芪、莱菔子、乌药、木香等水煎剂，药效性能主要是活血化瘀、益气开窍、疏通经洛、改善耳蜗内循环之功效[12～14]。按照《中药药理研究方法学》中的方法，按成人量(mg/kg)换算成动物剂量的倍数简表，换算出小鼠为4.5倍的剂量(这样就平衡人与鼠之间的较大差异)，计算出小鼠的每天口服用药量为5 ml，将中药盛于动物自吸喂养瓶内供小鼠自动饮用，对照组小鼠20只给予口服同剂量的饮用水。

1.3听性脑干反应(ABR)检测方法 动物于实验前、治疗30、60、90天后行ABR阈值检测。用0.75%戊巴比妥钠(0.1 mg/kg)麻醉后，用美国Inteligent Hearing Smart听觉诱发电位仪检测ABR，用针电极插入颅顶为记录电极，两侧耳垂皮下为参考电极，鼻尖为接地电极；click声刺激，刺激率19.1次/秒，高通滤波300 Hz，低通滤波3 000 Hz，平均叠加512次[13～15]。

1.4耳蜗铺片方法 各组动物检测ABR后，在麻醉状态下，各组取3只小鼠快速断头，迅速取出听泡，分离出耳蜗，在解剖显微镜下(OLYMPUS,TOKYO,297261)，用纤细钢针在耳蜗尖顶钻一小孔，将前庭膜挑破，再挑破圆窗膜和卵圆窗膜，并在耳蜗底回骨隆起处钻一小孔，看到外淋巴液溢出。马上用细的滴管吸取0.5%的硝酸银溶液，从蜗尖的小孔和两窗反复灌入，用双蒸馏水洗涤数次，再灌入10%的福尔马林固定液，在日光下曝光2～4小时，解剖显微镜下分离铺片。将基底膜按回放置在载玻片的甘油中，辨识正反面无误后，加盖盖玻片，供光镜观察和进行毛细胞计数。

1.5耳蜗毛细胞计数 在光镜下(Nikon DS-fi1)，耳蜗放大40倍，从耳蜗顶回开始逐个视野连续计数内外毛细胞存在和消失的数目，外毛细胞分排记录。计数完后，将三排外毛细胞的存在数与消失数由蜗顶到蜗底部逐个视野相加，计算出毛细胞损失的百分数；统计同一组的多个耳蜗相同部位的计数，制作毛细胞在耳蜗基底膜分布的存活百分率图及耳蜗毛细胞总存活数比较图。

1.6扫描电镜观察 动物断头处死后,分离取出双侧听泡,在手术显微镜下暴露出耳蜗,用细钢针挑破蜗顶和耳蜗底回圆窗及卵圆窗,快速灌入2.5 mmol/L戌二醛PBS液,置4 ℃固定4 h,入1.0 mmol/L锇酸固定2 h,PBS洗涤后在手术显微镜下去除耳蜗骨壳,盖膜及部分血管纹组织,充分暴露出Corti器上的基底膜内外毛细胞。梯度乙醇脱水,乙酸异戊酯梯度浸泡，二氧化碳临界点干燥,喷金,定位后在德国FEI Verios 460 L XHR SEM超高分辨率扫描电子显微镜系统上观察。

1.7全耳蜗铺片prestin抗体染色 各组小鼠治疗90天后取3只小鼠麻醉后，快速断头，分离出小鼠耳蜗，在体视显微镜下用纤细钢针在耳蜗顶回钻一小孔，沿基底膜挑破前庭膜，同时挑破圆窗膜和卵圆窗膜，将4%多聚甲醛滴注入耳蜗内。将标本浸入在4%多聚甲醛中4 ℃固定4 h，将耳蜗置入装有PBS缓冲液的培养皿中，在解剖显微镜下分离出耳蜗基底膜，PBS溶液中漂洗3次(5分/次)。0.5% Triton 1 h,将清洗后的基底膜标本加入10%正常羊血清Blocker封闭30 min，再用PBS溶液漂洗3次(5分/次)。将清洗后的基底膜标本加入配好的一抗anti-prestin(1∶500,3%羊血清溶液稀释)放入37 ℃温箱中过夜，次日取出标本用PBS溶液漂洗3次(5分/次)。将清洗后的基底膜标本加入二抗(1∶200，PBS溶液稀释)标记Alexa Fluor-488山羊抗兔抗体(1∶100，PBS溶液稀释)，室温下1 h，然后在PBS溶液漂洗3次(5分/次)。滴有DAPI核染液30 min后将标本平铺载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察(Leica TCS SP8)，用Image J软件分析荧光强度。

1.8耳蜗基底膜全蛋白提取和蛋白印迹实验(Western blot) 各组小鼠治疗90天后取3只小鼠用过量0.75%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头取出骨迷路，在干冰预冷的0.1 mol/L PBS中剥离耳蜗，取出基底膜组织，并在裂解液RIPA中粉碎，冰浴中多次剧烈振荡使组织充分裂解，离心后收集上清液。按照BCA试剂盒说明，用酶标仪测量蛋白溶液浓度，以每孔20 μg的上样量行SDS-PAGE凝胶电泳，用湿转法将蛋白电转移至规格为0.45 μm孔径的PVDF膜。经5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，用适当稀释的抗鼠β-actin抗体、羊抗小鼠SPAG6抗体或兔抗小鼠prestin抗体在3%奶粉TBST溶液中过夜孵育(4 ℃，≥8 h)。用PBS洗涤PVDF膜3×10分/次，用相应辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下水平缓慢摇动孵育1～2 h，用PBS洗涤3×10分/次，加入发光底物，在暗室内进行医用胶片的曝光并采集胶片图像。

1.9统计学方法 采用GraphPad Prism软件，比较组与组之间单个时间点的差别采用t检验或Mann-Whitney检验，比较两个实验组在一个或一个以上变量不同时间点间的差别使用ANOVA检验。各实验均重复3次或以上，非变量数据使用Mann-Whitney检验分析，多变量使用方差(ANOVA)分析。

2 结果

2.1各组实验前后ABR阈值比较 从表1可见实验前6组DBA/2J小鼠ABR反应阈为45～50 dB SPL，治疗后，疗效最好的是200 mg/kg阿司匹林加中药复聪汤治疗组，其次是中药复聪汤治疗组，再次是100 mg/kg阿司匹林加中药复聪汤治疗组；200 mg/kg阿司匹林治疗组的ABR反应阈随治疗时间的延长较缓慢升高，而100 mg/kg阿司匹林治疗组的ABR反应阈随治疗时间的延长快速升高，与饮水对照组基本相似，这三组治疗90天后的ABR反应阈值基本在60 dB SPL以上。从总的趋势看，200 mg/kg阿司匹林加中药复聪汤治疗组和单独中药复聪汤治疗组的效果相似，治疗90天后的ABR反应阈与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且200 mg/kg阿司匹林加中药复聪汤治疗组和单纯中药复聪汤治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)，而其余各组治疗90天后ABR反应阈较治疗前明显升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组动物治疗前后ABR反应阈值

2.2扫描电镜观察结果 治疗90天后中药复聪汤治疗组耳蜗顶回到底回的三排外毛细胞静纤毛束基本完整，排列整齐，纤毛束无散乱、缺失和融合现象(图1a～c)，仅顶回有散在个别的外毛细胞缺失，整个耳蜗内毛细胞无消失；100 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组耳蜗外毛细胞顶回基本无缺失(图1d)，中回个别消失(图1e)，基底回有30%的OHC消失(图1f箭头所示)；而200 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组的耳蜗顶回和中回无OHC缺失(图1g、h)，基底回有OHC1散在消失(图1i)，基底部IHC消失(图1)。

100 mg阿司匹林治疗组顶回三排外毛细胞静纤毛束基本完整，排列整齐，纤毛束无散乱、缺失和融合现象(图2a)，中回有OHC3散在消失(图2b)，底回的外毛细胞基本缺失(图2c)，整个耳蜗内毛细胞无消失；200 mg阿司匹林治疗组耳蜗外毛细胞顶回基本无缺失(图2d)，中回个别消失(图2e)，基底回有10%的OHC消失(图2f,箭头所示)；而饮水对照组的耳蜗顶回OHC1大量连续消失(图2g)，中回和基底回OHC全部的消失(图2h、2i)。

2.3各组耳蜗外毛细胞prestin表达和Western blotting蛋白定量检测结果 各组DBA/2J小鼠治疗90天后，200 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组的OHC prestin荧光标记强度最大，其次是200 mg阿司匹林治疗组，中药复聪汤治疗组的OHC中prestin荧光标记强度较强，而100 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组的OHC prestin荧光标记强度较弱，饮水对照组的OHC prestin荧光标记强度最弱(图3)。Western blot结果见图4，可见1～3号的prestin蛋白密度由最大依次减弱，而4～6号prestin蛋白密度最小。

2.4各组耳蜗基底膜铺片毛细胞计数比较 治疗90天后各组DBA/2J小鼠耳蜗外毛细胞存活总数最多的是中药复聪汤治疗组，与各组间差异有统计学意义(P<0.05)；其次是200 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组，再次是200 mg阿司匹林治疗组，100 mg阿司匹林治疗组最少，从耳蜗顶回到底回OHC存活率见图5。

3 讨论

为了探讨更有效的延缓老年性聋发展的措施，本研究在前期研究修复和再生耳蜗毛细胞的基础上[12,13]，用阿司匹林肠溶片联合中药复聪汤对ARHL DBA/2J小鼠(老年性聋小鼠)进行治疗，观察其对小鼠听功能和耳蜗毛细胞的保护效果，结果表明，无论是对耳蜗OHC的存活还是OHC prestin的表达，单独中药治疗组的效果均为最好；而治疗前后ABR反应阈值的比较显示200 mg阿司匹林加中药治疗组效果更好，其次是单独中药治疗组，说明阿司匹林虽然没有促进OHC的存活，但可促进OHC prestin的表达，亦对听功能的改善有一定作用。有研究报告，耳蜗底回的毛细胞较顶回更易受到自由基的损害，水杨酸能显著改善底回毛细胞的存活[16]，但本研究并没有观察到该结果，这可能与本研究采用的动物种系有关，因为已有研究表明不同种系的动物对卡路里限制(caloric restriction，CR)的抗氧化预防治疗年龄相关性听力损失效果不同，其中DBA/2J小鼠效果较差[17,18]。根据既往研究结果，结合本研究结果，老年性聋小鼠耳蜗毛细胞损失始于基底部，要有效地预防和治疗老年性聋，关键是要采取切实可行措施以促进耳蜗基底部的毛细胞存活和延缓或阻止毛细胞死亡。在研究治疗措施时，要考虑到耳蜗顶部与基底部毛细胞的遗传及分子机制的差异问题，以及药物分子作用的靶点和途径不同，还要考虑到耳蜗结构与病理改变的时空序列，以及预防治疗策略之间多方面的科学契合问题。

文中结果显示，单独中药复聪汤治疗组对延缓老年性聋的效果更好，其次是200 mg阿司匹林加中药复聪汤治疗组，说明中药的治疗作用是正向促进毛细胞存活，而200 mg阿司匹林+中药治疗组的中西药联合或许有一定的毒副作用，阿司匹林仅对耳蜗OHC prestin表达有特异的促进作用。既往研究表明，毛细胞的存活与螺旋神经元(SGNs)的状态有密切关系，毛细胞对于螺旋神经元的存活是必需的，毛细胞消失或毛细胞功能消失后，SGNs不能激活或最大程度减低电激活水平；毛细胞死亡后SGNs也很快消失，连接到Corti器的外周轴突甚至死亡[17～20]；这些研究从另一方面提示了耳蜗组织退变的系列连贯性病理改变以及病变的时空分类或程度。所以，在治疗年龄相关性听力损失时，除了促进毛细胞恢复，同时还要充分考虑对螺旋神经元等组织的修复作用；而本课题组的前期实验亦证明中药复聪汤对老年性聋小鼠的耳蜗OHC prestin表达有促进作用[15]。在临床治疗方面，雷剑波等[14]应用复聪汤治疗45例神经性聋患者，结果证明复聪汤能降低患者血清NO、Connexin26、Connexin30的表达水平，临床疗效显著。因此，阿斯匹林联合复聪汤治疗老年性聋并不具备明显的优势，而复聪汤的组方似乎更为合理，其组方中含有多种化学成分，可能具有多靶点的治疗作用，这也是该中药治疗的优势所在；但更有效的组方或更有效的治疗药物组合尚需进一步探讨。除了继续探索合理的治疗方法及途径之外，可能关键的问题尚未探明，即老年性聋耳蜗毛细胞的死亡方式可能并不是只有凋亡一种机制，可能还存在尚未探明的死亡方式和时空序列，如何阻止和逆转这种进程，是今后尚待继续深入探索和研究的课题。