葵花籽粗油体中内源性蛋白酶系的性质探究以及鉴定

单秀民，彭 姣，陈业明

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

近年来有学者在对植物油料种子水相加工过程中发现了内源性蛋白酶，且发现这些内源性蛋白酶可以在特定的条件下水解自身的蛋白质，还发现水解油质蛋白的程度越大，破乳率越高[1-2]。油质蛋白是稳定油体结构(脂肪存贮的细胞器)的重要蛋白质[3]。组成油体结构的蛋白质包括油质蛋白、油体钙蛋白和油体固醇蛋白[4]。赵路苹[1]在大豆粗油体中发现一种内源性蛋白酶——半胱氨酸蛋白酶，可以水解油质蛋白。陈雅静[2]在对花生进行湿法磨浆后离心分离，对获得的上浮层(即粗油体，富含油脂和少量的蛋白质)进行研究，发现其中存在一种天冬氨酸蛋白酶，可以在一定条件下水解油体外源性蛋白(不组成油体结构的蛋白质)和油体内源性蛋白，在温度和酶的共同作用下，使得粗油体破乳率高达94.73%。研究[1,5]报道，葵花籽粗油体在35℃、pH 6.5时14.1～19.2 kDa 油质蛋白会被水解，水浴9 h后17.3～19.2 kDa 油质蛋白水解了34.89%，14.1 kDa油质蛋白水解了29.07%；葵花籽粗油体在70℃和 pH 5下反应 2 h，破乳率可达到 90%以上。这些研究表明植物油料种子中的内源性蛋白酶具有一定的差异和较好的应用前景。

目前，对葵花籽粗油体中内源性蛋白酶的种类及其性质的探究未见报道。因此，本文对葵花籽粗油体中内源性蛋白酶系的性质进行探究及鉴定。通过湿法打浆，对葵花籽浆液进行离心分离，获得上浮层(即粗油体)和其他部分，其他部分可以进一步加工处理制备蛋白粉。研究葵花籽粗油体中内源性蛋白酶的最适水解pH、水解温度和蛋白酶的鉴定，为葵花籽粗油体利用内源性蛋白酶破乳提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葵花籽，购于内蒙古巴彦淖尔；氢氧化钠、盐酸，分析纯，购于国药集团；10～250 kDa标准蛋白，购于美国Bio-Rad公司；其他试剂，购于美国Sigma公司。

上海泸西90型磁力搅拌器，梅特勒台式pH计，九阳JYL-Y5破壁料理机，日本Himac CR-21GⅡ冷冻离心机，Mini-PROTEAN型垂直电泳仪，ChemiDoc XRS+凝胶成像仪,Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher)。

1.2 实验方法

1.2.1 粗油体的制备

将葵花籽去壳后加5倍的去离子水浸泡，置于4℃放置18 h，然后加入其原始质量9倍的去离子水，使用九阳破壁料理机以18 000 r/min的速度打浆2 min，后用四层纱布过滤将滤渣除去，滤液为葵花籽浆。将葵花籽浆置于冷冻离心机，保持4℃，4 000 r/min离心15 min，收集上浮层。上浮层即为葵花籽粗油体。

1.2.2 粗油体中内源性蛋白酶系作用的最适pH和温度的探究

将葵花籽粗油体用去离子水稀释使其蛋白质质量浓度为4 mg/mL,分为9份，分别调节pH至3、4、5、6、7、8、9、10、11后，置于50℃水浴2 h，取样进行Tricine-SDS-PAGE分析。

将葵花籽粗油体用去离子水稀释使其蛋白质质量浓度为4 mg/mL,调节至作用的最适pH,分为6份，分别置于30、40、50、60、70、80℃水浴2 h，取样进行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.3 抑制剂对于粗油体中内源性蛋白酶系的影响

参考Wilson等[6]的方法并作一定修改。向稀释至4 mg/mL的粗油体中分别添加0、0.5、1 mmol/L AEBSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，0、2、4 μmol/L Pepstatin-A(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)，0、0.25、0.5 mmol/L E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)，0、5、10 mmol/L EDTA-2Na(金属蛋白酶抑制剂)后，调至pH 4，置于50℃进行水浴，在0、2、4 h取样，进行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE分析

用去离子水将粗油体稀释至蛋白质质量浓度为4 mg/mL。取稀释后的样品0.5 mL 与0.5 mL Tricine-SDS-PAGE样品缓冲液(0.25 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)，1% SDS，2%巯基乙醇和0.02%溴酚蓝)混合[7]。置于沸水浴中煮3 min，冷却后作为还原性Tricine-SDS-PAGE的上样样品。根据Schagger[8]的方法，使用16%的丙烯酰胺分离胶和4%的丙烯酰胺浓缩胶进行。加入10 μL样品于电泳泳道中，并以30 V、45 mA进行电泳约1 h，直到蓝色线(蛋白质被溴酚蓝染成蓝色)进入分离胶，然后再以100 V、45 mA进行电泳，直至电泳结束。后经过固定，考马斯亮蓝G-520染色，脱色干净后使用Image Lab 3.0软件分析条带强度。

1.2.5 LC-MS/MS分析

将粗油体加入TCA使其质量分数为15%，静置4 h后，于8 000 r/min离心20 min，取沉淀进行冻干，取适量的冻干粉加入40 μL 胰蛋白酶缓冲液，37℃ 孵育16～18 h。取水解液过0.22 μm水膜，然后经毛细管高效液相色谱分离后用Q Exactive质谱仪进行质谱分析，用MaxQuant1.5.5.1检索。

2 结果与讨论

2.1 pH对内源性蛋白酶活性的影响(见图1)

葵花籽粗油体中含有多种油质蛋白，相对分子质量分别是14.1、17.3、18.1、19.2 kDa，油体钙蛋白相对分子质量分别是25 kDa和28 kDa，油体固醇蛋白相对分子质量是37 kDa[9-10]。葵花籽粗油体中还含有大量外源性蛋白，分别是11S球蛋白和2S清蛋白。11S球蛋白的酸性肽链(11S-A)相对分子质量在26～36 kDa，碱性肽链(11S-B)相对分子质量在17～24 kDa[11]；2S清蛋白相对分子质量在4～20 kDa[12]。

通过对图1(a)的电泳图进行灰度分析得到图1(b)，发现在pH 4、50℃下油质蛋白水解速度最快，水浴2 h后相对于空白被水解59%。油质蛋白在pH 3时水解速度较慢，2 h水解不到4%，在pH 5～pH 8，油质蛋白水解相对较快。这说明葵花籽粗油体中的内源性蛋白酶系偏向于中酸性环境下水解油质蛋白，且水解油质蛋白的最佳pH是4。因为11S球蛋白在所提取的葵花籽粗油体中的占比在80%以上，因此对占比较大的22 kDa(11S-B)球蛋白和35 kDa(11S-A)球蛋白进行分析。发现22 kDa球蛋白与油质蛋白有着类似的水解规律，也是在pH 4的水解速度最快，但pH 3时的水解速度较快，当pH大于5时，越往碱性方向偏移，水解速度越慢。而35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度较快，pH 3和pH 9～11均水解较慢。因此，pH 4是粗油体中绝大部分蛋白质的最佳水解pH。

2.2 温度对内源性蛋白酶活性的影响

将稀释后的粗油体调pH至4，置于30～80℃水解2 h，取样进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果见图2。由图2b可见，在pH 4时，油质蛋白在50℃时水解速度最快，2 h可以水解59%左右。22 kDa球蛋白也在50℃水解程度最大，2 h可以水解28%，35 kDa球蛋白也有着相同的水解规律。

2.3 抑制剂对于内源性蛋白酶活性的影响(见图3)

从图3和添加不同抑制剂后对应实验的电泳图以及22 kDa球蛋白与35 kDa球蛋白灰度分析结果(图略)可知，Pepstatin-A的添加对于油质蛋白、22 kDa和35 kDa球蛋白的水解均有一定的抑制效果，AEBSF对葵花籽粗油体中的蛋白也有微弱的抑制效果，而E-64的添加对粗油体中的蛋白水解并无影响，EDTA-2Na的抑制效果最为明显，当EDTA-2Na的浓度为5 mmol/L时，4 h后油质蛋白剩余73%左右，22 kDa和35 kDa几乎不水解，不添加抑制剂水解4 h油质蛋白可以被完全水解，22 kDa被水解43%，35 kDa被水解69%左右，因此表明在pH 4时，金属蛋白酶能水解葵花籽粗油体中的大部分蛋白质。添加EDTA-2Na抑制剂后，很多条带浓度均变深，原因有待进一步研究。但抑制剂实验结果显示不添加抑制剂水解 4 h油质蛋白可以被完全水解，当Pepstatin -A浓度为4 μmol/L时，4 h 后油质蛋白还能被水解60%；当AEBSF浓度为1 mmol/L时，4 h后油质蛋白还能被水解90%，这表明还有其他酶类对油质蛋白进行水解。综合4个电泳图结果可知，在pH 4时，水解葵花籽粗油体中的蛋白质的是金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。

2.4 内源性蛋白酶系以及蛋白酶抑制剂的鉴定(见表1)

表1 蛋白酶与蛋白酶抑制剂LC/MS-MS鉴定结果

从表1可知，所提取得粗油体中1～9属于金属蛋白酶类，有CAAX prenyl protease 1 homolog isoform X 2(金属肽酶M 48家族)、Amino peptidase M 1(氨肽酶M 1：金属肽酶M 1家族)、Leucine amino peptidase1-like(亮氨酸氨肽酶：金属肽酶)、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Signal peptidase complex catalytic subunit SEC 11 A-like、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Putative signal peptidase complex subunit 2、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial。说明体系中金属蛋白酶主要是肽酶，且总的丰度在0.000 098 36。10～13是天冬氨酸蛋白酶类，有Aspartic proteinase Asp 1-like、Aspartyl protease AED3-like、Aspartyl protease family protein 2-like、Protein ASPARTIC PROTEASEIN GUARDCELL 1-like，且总丰度为0.000 296 13。14～15是丝氨酸蛋白酶，有Tripeptidyl-peptidase 2(三肽基肽酶)、Serine carboxy peptidase-like(丝氨酸羧肽酶)，且总丰度为0.000 117 34。没有检测到半胱氨酸蛋白酶类，这与抑制剂实验结果一致。在粗油体体系中天冬氨酸蛋白酶类的丰度大于丝氨酸蛋白酶类，丝氨酸蛋白酶类大于金属蛋白酶类。但是抑制剂实验结果显示金属蛋白酶类对粗油体中蛋白水解抑制程度最大，这可能是由于表1中序号为16～24等抑制剂存在的原因[13]。16～17是Kunitz抑制剂，其可以抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶[14]。18～20是丝氨酸蛋白酶类抑制剂。21～24是半胱氨酸蛋白酶类抑制剂。在粗油体体系中并未鉴定出金属蛋白酶类抑制剂。抑制丝氨酸蛋白酶类的抑制剂丰度可达到0.000 498 30，抑制天冬氨酸蛋白酶类的抑制剂丰度为0.000 441 23，这些抑制剂使得丰度较高的天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶作用弱于金属蛋白酶。

3 结 论

葵花籽粗油体中存在内源性蛋白酶系，此蛋白酶系在pH 4时油质蛋白和11S球蛋白水解速度最快。油质蛋白在pH 4～8水解速度相对较快，22 kDa球蛋白在pH 3～5水解速度相对较快，35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度相对较快。在pH 4条件下该蛋白酶系的最佳水解温度是50℃。通过抑制剂添加实验和LC-MS/MS鉴定发现粗油体中存在金属蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和丝氨酸蛋白酶类，且天冬氨酸蛋白酶类的丰度大于丝氨酸蛋白酶类，丝氨酸蛋白酶类大于金属蛋白酶类。