月桂酸酸解棕榈硬脂合成中长链脂肪酸甘油三酯的工艺优化及其理化性质分析

李 闯，赵国群，李 阳，张 辉，冯凤琴

(1.河北科技大学 生物科学与工程学院，石家庄050000； 2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，杭州310000)

油脂是食品的重要组成部分，作为机体不可缺少的营养元素之一，一方面要为机体提供能量，另一方面发挥着特殊的健康作用。随着人们生活水平的提高，过多摄入油脂导致的肥胖和不良的生活方式已经成为了心血管疾病的重要危险因素[1]。中长链脂肪酸甘油三酯(MLCT)是一类结构脂质(SLs)，因其同时具备中链和长链脂肪酸，在为机体供能的同时避免了脂肪堆积，从而利于健康，在食品工业中应用越来越广[2]。根据甘油三酯(TAGs)在体内代谢的特点，MLM型MLCT位于sn-1,3位的中链脂肪酸可以快速水解代谢[3]，具有更好的代谢优势，一直以来都是MLCT的主要研究方向。

月桂酸是一种特殊的脂肪酸，在中链脂肪酸中其碳链最长，虽然属于饱和脂肪酸，但不具有心血管疾病风险。研究表明，月桂酸占脂肪酸50%左右的椰子油具有很好的健康功能，南亚等一些地区使用椰子油作为主要的食用油脂，其心血管疾病风险降低[4-5]。除此之外，椰子油还有一些特殊功能，如抑菌、消炎[6-7]，而且在对结肠癌细胞的诱导凋亡中月桂酸表现出了很好的效果[8]。在MLCT的研究中，月桂酸越来越受到重视，一方面富含月桂酸的中链脂肪酸甘油三酯被引入市场，用于色拉油和烹饪，具有很好的功能优势，如促进心脑血管的健康。另一方面，相较于利用传统的辛酸和癸酸合成的MLCT，富含月桂酸的MLCT烟点更高，应用范围更广[9]。这些研究表明，月桂酸作为中链脂肪酸合成MLCT具有很好的应用前景。人乳脂中有20%左右的棕榈酸，且主要位于TAGs sn-2位，研究表明sn-2棕榈酸油脂可以促进钙的吸收，预防因sn-1,3位棕榈酸与钙离子结合造成的便秘[10-11]。除此之外，sn-2棕榈酸油脂还可以提高骨骼生长速度,有利于肠道益生菌群生长，提高骨矿物质含量及密度,促进大脑发育等[12]。所以，LaPLa(La，月桂酸；P，棕榈酸)型甘油三酯具有很好的结构优势。虽然椰子油中含有大量月桂酸和部分棕榈酸，但是分子中同时含有两个月桂酸和一个棕榈酸的TAGs含量很低，约为1.51%，并且月桂酸和棕榈酸并没有特定位点[13]。富含LaPLa的MLCT具有典型的代谢和功能优势，一方面含有较多具有健康功能的中链脂肪酸月桂酸，另一方面含有较多的sn-2位棕榈酸，具有很好的应用前景。

国内对于MLCT的研究相对较晚，最常用的方法是酶催化中链脂肪酸甘油三酯与长链脂肪酸甘油三酯反应的酯交换法。这种方法原料利用率高，易于实现工业化，但合成的目的产物脂肪酸位置特异性差。随着对MLM型MLCT的深入研究，酸解法在追求脂肪酸位置特异性方面表现出了更大的优势。本研究设计了一种以月桂酸为酰基供体合成的新型MLCT，即以sn-1,3位特异性脂肪酶催化月桂酸酸解棕榈硬脂合成富含LaPLa的MLCT，筛选了脂肪酶，对合成工艺进行了优化，检测了合成的MLCT理化性质，为开发新型功能性MLCT奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

固定化脂肪酶RM IM、 TL IM，诺维信(中国)生物技术有限公司；固定化脂肪酶AO IM，杭州康源食品科技有限公司；58℃棕榈硬脂(PS)，南京新实力食品科技有限公司；月桂酸， 阿拉丁公司；脂肪酸甲酯混标，美国Sigma公司；正己烷，气相色谱纯，阿拉丁公司；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.1.2 仪器与设备

GC-2014气相色谱仪，日本岛津；7890A-5975C气质联用仪，美国安捷伦；THZ-82水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DSC Q200差示扫描量热仪，美国TA公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；L600-A离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 月桂酸酸解棕榈硬脂合成MLCT

在100 mL圆底烧瓶中加入一定摩尔比的PS和月桂酸，充入氮气，盖上翻口塞，置于一定温度恒温水浴振荡器一段时间，待反应底物混合均匀且呈液态后，加入一定量的固定化脂肪酶，再次充入氮气保护，盖上翻口塞，200 r/min条件下反应一定时间，得到产物。每个试验做3组平行。根据产物中LaPLa含量对合成条件进行优化。

1.2.2 MLCT的纯化

MLCT的纯化在潘向昆等[14]的方法基础上进行了修改，具体为酸解反应结束后，过滤掉固定化酶，收集混合物料于分液漏斗中，加入混合物料12倍体积的正己烷和5倍体积的95%乙醇，加3滴酚酞试剂混匀，滴加0.5 mol/L KOH溶液并不断摇晃，直到溶液出现粉红色且30 s内不褪色，振摇1 min，静置收集正己烷相，重复操作，合并两次收集的正己烷相，用饱和NaCl溶液洗涤，旋蒸除去有机溶剂得较为纯净的MLCT。

1.2.3 脂肪酸组成的测定

参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》以及GB/T 24894—2010《动植物油脂 甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定》进行脂肪酸甲酯化和气相色谱分析。以标准品保留时间定性，面积归一化法定量，确定脂肪酸组成及含量。

GC条件：GC-2014气相色谱仪；DB-23毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)(美国安捷伦)；FID检测器；进样口温度250℃；检测器温度300℃；载气为氮气；分流比10∶1；进样量1 μL；柱温程序为初始温度100℃，保持2 min，以10℃/min升至160℃，保持4 min，以10℃/min升至210℃，保持5 min，再以10℃/min升至240℃，保持10 min，整个分析时长35 min。

1.2.4 甘油三酯分析及LaPLa含量测定

取10 μL样品两份，分别加入1 mL正己烷，混匀后过0.22 μm有机膜，进气质联用仪检测和气相色谱仪检测。

对甘油酯和游离脂肪酸通过气质联用定性并确定其出峰顺序。对比出峰顺序，结合气相色谱图，不积分游离脂肪酸峰面积，采用面积归一化法计算对应甘油三酯含量。每个试验做3组平行。LaPLa(参照GB 30604—2015《食品营养强化剂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯》，以C40甘油三酯计)含量按下式计算。

(1)

式中：X为LaPLa的含量；S1为气相色谱图中LaPLa对应的峰面积；S2为气相色谱图中所有甘油酯对应的峰面积总和。

GC-MS条件：7890A-5975C气质联用仪；DB-1HT色谱柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美国安捷伦)；进样口温度320℃；进样量1 μL；分流比10∶1；恒流模式，柱流速1 mL/min；柱温程序为初始温度200℃，以5℃/min升到350℃，保持5 min；EI离子源；离子源温度300℃；四级杆温度200℃；质量数(m/z)扫描范围33～1 000 u。

GC条件：GC-2014气相色谱仪；DB-1HT色谱柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美国安捷伦)；进样口温度320℃；FID检测器温度370℃；进样量1 μL；分流比10∶1；柱压力200 kPa；柱温程序为初始温度200℃，以8℃/min升到350℃，保持5.25 min。

1.2.5 结晶熔融特性分析

用DSC Q200差示扫描量热仪，参照Korma等[15]的方法测定甘油三酯的熔融起始温度和结晶起始温度。首先，称量8～12 mg的样品置铝盒并密封。样品在30℃/min下快速从室温加热至80℃，并保持10 min，破坏原有的晶体结构。然后以10℃/min冷却至-40℃，保温30 min。最后，以10℃/min加热至80℃。所有样品重复测定3次，取平均值。

1.2.6 理化性质检测

酸价测定参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；过氧化值测定参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》；碘值测定参照GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》。

1.2.7 数据处理

试验所得的数据采用SPSS Statistics进行显著性分析，P<0.05为显著性差异。使用OriginPro 8.0和GraphPad Prism 6.0进行绘图分析。数据表示为“x±s”(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 PS脂肪酸组成(见表1)

表1 PS脂肪酸组成 %

PS是从棕榈油中分提出来的一种油脂，其特点是含有大量的棕榈酸和部分油酸，且sn-2位棕榈酸含量很高，这种特殊的组成结构使其成为合成结构脂质的很好的天然原料[16-17]。由表1可以看出，PS中脂肪酸种类较少，不含月桂酸，棕榈酸含量达到73.71%，sn-2位棕榈酸含量也达到了66.83%。这种sn-2位含有大量棕榈酸的特殊结构，成为合成高含量LaPLa的基础。

2.2 固定化脂肪酶对合成LaPLa的影响(见图1)

原料中使用的是熔点为58℃的棕榈硬脂，所以将3种酶的反应温度都设在60℃。由图1可以看出，3种酶表现出了不同的活力和反应程度，即反应速率和终产物中LaPLa含量。其中TL IM的活力和反应程度最低，LaPLa含量上升速度较慢，在最后反应达到平衡时，其LaPLa含量较低，为(22.51±0.41)%。RM IM和AO IM两种酶在反应达到平衡时，其LaPLa含量没有显著性差异，分别是(32.78±0.50)%和(32.38±0.30)%，但前者的反应时间(8 h)要远远长于后者(4 h)，AO IM表现出了很高的催化效率。需要注意的是，AO IM随着反应的进行，LaPLa含量会下降，这是因为有三月桂酸甘油酯(LaLaLa)的生成。试验中，当LaPLa含量趋于平衡时，随着反应继续进行，LaLaLa开始生成且含量越来越高，这可能是因为反应后期酰基迁移的影响，以及过高的月桂酸影响了脂肪酶特异性，这与Zhang等[18]的试验结果相符合。因此，控制好反应时间，AO IM可以满足此合成工艺，后续工艺优化选取AO IM 作为生物催化剂。

注：反应条件为反应温度60℃，底物(棕榈硬脂与月桂酸，下同)摩尔比1∶8，酶载量8%(相对于底物质量，下同)。

2.3 AO IM催化合成MLCT工艺优化

2.3.1 反应温度对合成LaPLa的影响(见图2)

注：反应条件为底物摩尔比1∶8，酶载量4%。

在PS的基础上，因为有月桂酸的存在，使整个反应体系熔点降低，在50℃下也能熔融。温度一方面会影响体系的黏度，进而影响分子之间的相互作用，另一方面会影响酶的活力[19]。由图2可以看出，随着反应温度从50℃不断地升高，酶的活力越来越强，反应达到平衡所用的时间越来越短，65℃时最短，为3 h。当反应温度达到70℃时酶的活力下降，反应达到平衡的时间延长，反应速率降低。这可能是因为温度过高，使部分酶失活，整体催化能力降低。所以，选择65℃作为酶催化合成试验的下一步优化基础。

2.3.2 酶载量对合成LaPLa的影响(见图3)

注：反应条件为反应温度65℃，底物摩尔比1∶8。

通常情况下，反应速率会随着酶载量的升高而升高，直到达到过载点为止，过高的酶载量会促进底物扩散，继而抑制酶的活性[20]。由图3可以看出，随着酶载量的不断升高，反应速率越来越快，达到平衡时间越来越短，但是反应达到平衡时LaPLa含量没有显著性差异，说明酶载量对LaPLa合成速率影响大，对反应程度影响小，即对终产物含量影响小，这与Araújo等[21]报道的结果吻合。12%酶载量合成反应最先达到平衡，1.5 h时LaPLa含量可达到(32.43±0.87)%，与10%酶载量合成反应1.5 h的结果((31.19±0.03)%)没有显著性差异，而与8%酶载量合成反应1.5 h的结果((28.76±0.16)%)有显著性差异。这说明，酶载量从10%提高到12%已经不能显著提高反应速率，过高的酶载量使反应快速平衡，同时加快了酰基迁移[22]。另外，考虑到脂肪酶的成本，选择10%为最适酶载量，作为酶催化合成试验的下一步优化基础。

2.3.3 底物摩尔比及反应时间对合成LaPLa的影响(见图4)

注：反应条件为反应温度65℃，酶载量10%。

由图4可以看出，随着底物摩尔比的不断升高，反应平衡时LaPLa含量越来越高，反应在2.5 h时基本都达到了平衡，说明底物摩尔比对LaPLa合成速率影响小，对终产物含量影响大。底物摩尔比为1∶12时反应2.5 h时达到平衡，LaPLa含量为(41.12±0.18)%，反应3 h LaPLa含量升高但没有显著性差异。底物摩尔比为1∶10反应2.5 h达到平衡且终产物含量最高，为(40.59±0.29)%，与底物摩尔比1∶12的LaPLa含量相比没有显著性差异，而与底物摩尔比1∶8的相比有显著性差异，故1∶10是该酶促合成反应的底物摩尔比饱和值。同时，当底物摩尔比增加到1∶10和1∶12时，在反应的起始阶段反应速率较慢，这可能是过高的底物摩尔比导致pH过低，影响了酶的活性[23-24]，而随着反应的进行反应速率又逐渐加快。故底物摩尔比和反应时间的优化结果分别为1∶10和2.5 h。

综上所述，月桂酸酸解棕榈硬脂合成富含LaPLa的MLCT的最佳条件为：底物摩尔比1∶10，反应温度65℃，酶载量10%，反应时间2.5 h。在最佳条件下，LaPLa的含量为40.59%。

2.4 纯化后MLCT脂肪酸和甘油三酯组成

在最佳工艺条件下合成并纯化MLCT，测定其脂肪酸组成，结果见表2。

表2 纯化后MLCT脂肪酸组成 %

由表2可以看出，纯化后MLCT月桂酸的掺入率达到了50%，同时反应中发生了酰基迁移，部分月桂酸掺入到了sn-2位。sn-2位棕榈酸含量有所下降，但仍达到了59.91%。

反应后的混合物经脱酸纯化后，其甘油三酯组成和含量与纯化前基本吻合。纯化后LaPLa的含量为(41.64±0.51)%，LaLaLa的含量低于8%，PPP的含量低于1%。

2.5 纯化后MLCT的熔融特性(见图5)

油脂的熔融特性与脂肪酸和甘油三酯的类型有关，短链、中链脂肪酸和不饱和脂肪酸含量高的油脂比长链脂肪酸含量高的油脂熔融温度低[25]。由图5A可以看出，MLCT结晶起始温度(17.58℃)较PS(42.04℃)低，在14.71℃处观察到结晶峰，说明MLCT具有更低的结晶点，这些都与月桂酸的掺入有关。由图5B可以看出，MLCT熔融温度较PS大幅降低，熔融峰从58.24℃降为33.74℃，熔融起始温度为23.97℃，曲线的基线相对平滑，这说明经酶促酸解反应后形成了新的甘油三酯分子(MLCT)，且该油脂成分组成相对单一。熔融峰为33.74℃，低于人体温度(36～37℃)，这一特性有助于其在婴幼儿食品中的应用，可在体温下完全融化进入人体代谢，有利于消化吸收。

2.6 纯化后MLCT的理化性质

在最佳工艺条件下合成并纯化MLCT，测定其理化性质，结果见表3。

表3 PS和MLCT理化性质

由表3可以看出，合成的MLCT经纯化后酸价有所下降，但和PS相比没有显著性差异(P>0.05)。过氧化值表示油脂的氧化程度，是衡量油脂品质的一个重要指标。MLCT较PS过氧化值显著(P<0.05)升高，这可能是因为在试验过程中高温和酸性环境等加快了油脂的氧化，使过氧化值升高。碘值是衡量油脂不饱和度的指标，PS中部分不饱和脂肪酸被月桂酸取代，造成MLCT碘值显著(P<0.05)低于PS。

3 结 论

本研究通过月桂酸酸解PS合成一种结构相对单一的MLCT，即富含LaPLa的MLCT，优化了合成工艺，检测了纯化后MLCT的理化性质。结果表明：固定化脂肪酶AO IM具有良好的催化性能，在反应温度65℃、酶载量10%、底物摩尔比1∶10、反应时间2.5 h的工艺条件下，LaPLa的含量可达到40.59%；与PS相比，纯化后的MLCT酸价和碘值有所降低，过氧化值显著升高，结晶起始温度和熔融起始温度都有所降低。合成的富含LaPLa的MLCT具有典型的结构特点，即尽可能将月桂酸的功能与MLM型MLCT代谢优势结合起来，同时sn-2位保留大量棕榈酸，有利于在婴幼儿食品中的应用，为新型MLCT的合成提供了研究思路。