核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及稳定性研究

张丽娜，孔祥珍，华欲飞

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

糖尿病是世界上最普遍和发展最快的慢性代谢疾病之一，其中2型糖尿病占90%～95%[1-2]。二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)抑制剂是针对2型糖尿病的最新治疗方法[3]。肠促胰岛素包括胰高血糖素样肽1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)，具有维持血糖稳态的作用。DPP-IV是一种普遍存在的酶，可以降解肠促胰岛素，引起血糖控制水平的紊乱[4]。因此，通过抑制DPP-IV的活性来防止内源性肠促胰岛素的降解，从而可以更好地实现血糖调节。目前，许多天然的食物蛋白质，例如牛奶、燕麦、大米和鲢鱼等，都是DPP-IV抑制肽的良好来源[5-8]。

核桃粕是核桃油提取过程的副产物，含有丰富的蛋白质，被认为是生产生物活性肽的潜在来源[9]。为了充分利用核桃的蛋白质资源，创造高附加值产品，将核桃粕在蛋白酶作用下水解，以提供更具市场价值的核桃蛋白水解物，赋予其对人类健康有益的功能特性。据报道，通过蛋白酶水解产生的核桃蛋白水解物具有多种生物活性，包括抗氧化性、ACE抑制活性、抗高尿酸活性、抗增殖活性和神经保护活性等[10-13]。但迄今为止，尚未报道核桃蛋白水解物的DPP-IV抑制活性。因此，研究核桃蛋白DPP-IV抑制肽具有巨大的潜力。

本文首先研究了由5种商业蛋白酶水解的核桃蛋白水解物的DPP-IV抑制活性，选择制备DPP-IV抑制肽的最适水解酶，通过超滤结合离子交换层析分离纯化高活性DPP-IV组分。随后，研究了温度、pH和模拟胃肠道消化对核桃蛋白DPP-IV抑制肽活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

核桃粕，晨光生物科技集团股份有限公司；碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶，诺维信(中国)生物技术有限公司；二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)、甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)，Sigma公司；SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱，GE公司；乙腈，色谱纯；盐酸、冰醋酸、氢氧化钠、氯化钠、乙酸钠、甘氨酸、三羟基氨基甲烷、三氟乙酸，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

SC-15智能节能恒温槽，HimacCR-21G型冷冻离心机，D-2000 Elite高效液相色谱仪，SCIENTZ-10ND冷冻干燥机，Enspire型多功能酶标仪，Agilent 1100型全自动氨基酸分析仪，赛普膜分离装置。

1.2 实验方法

1.2.1 核桃蛋白的酶法水解

将核桃粕按料液比1∶10分散在去离子水中，温育至每种蛋白酶的最适温度，酶添加量为2%，所有反应均在每种酶的最适pH下水解5 h(最适水解条件见表1)。水解结束后调节pH至中性，100℃加热10 min灭酶，然后冰水浴冷却至4℃，再在9 000 r/min下离心20 min，取上清液冷冻干燥，得核桃蛋白水解物，-20℃保存。

表1 不同酶的最适水解条件

1.2.2 水解度的测定

核桃蛋白的水解度按照pH-stat方法测定[14]，记录水解过程中NaOH的添加量，按下式计算水解度(D)。

D=B×cb/(α×mp×htot)×100%

(1)

式中：B为NaOH消耗量，mL；cb为NaOH的浓度，mol/L；mp为核桃蛋白的质量，g；htot为核桃蛋白肽键总数，mmol/g(核桃蛋白htot=7.35 mmol/g)；α为α-氨基的解离度。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE分析

参考Schagger[15]的方法。取适量样品与样品溶解液混合，稀释至蛋白质量浓度为2 mg/mL，还原电泳需加入20 μL 1 mol/L DTT煮沸5 min，上样10 μL。浓缩胶4%、分离胶16%，样品在浓缩胶中电压为30 V，进入分离胶调整电压为100 V，直至电泳结束。将所得凝胶固定、染色和脱色，然后用凝胶成像仪扫描拍照。

1.2.4 DPP-Ⅳ抑制率的测定

根据Zhang等[16]的方法测定。在96微孔板中，将25 μL一定质量浓度的样品(溶解在pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液中)与25 μL Gly-Pro-PNA(1.6 mmol/L)混合，在37℃孵育10 min，加入50 μL DPP-Ⅳ(8 U/L)，于37℃反应60 min，然后添加100 μL乙酸钠缓冲液(1 mol/L，pH 4.0)中止反应，于405 nm处测量吸光度。以Tris-HCl缓冲液代替DPP-Ⅳ溶液作为空白组，以Tris-HCl缓冲液代替样品作为对照组测量吸光度。按下式计算DPP-Ⅳ抑制率(Y)。

(2)

式中：As、Ab和Ac分别为样品组、空白组和对照组的吸光度。

1.2.5 DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化

1.2.5.1 超滤

将碱性蛋白酶水解物冻干样品溶于去离子水配制成50 mg/mL溶液，依次通过10 kDa和5 kDa的超滤膜，收集不同相对分子质量(>10 kDa、5～10 kDa、<5 kDa)的肽组分，冷冻干燥并保存在-20℃下，测定不同组分的DPP-Ⅳ抑制率。

1.2.5.2 阳离子交换层析

SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱用50 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 4.0)平衡，将超滤后冻干的小于5 kDa的组分用10 mmol/L乙酸缓冲液(pH 4.0)配成质量分数10%的溶液后上样，首先收集未吸附的组分A，然后用含2 mol/L NaCl的醋酸缓冲液洗脱，收集组分B，将A、B组分分别浓缩，并用截留相对分子质量为100 Da的透析袋在去离子水中透析48 h，冷冻干燥并保存在-20℃下，测定不同组分的DPP-Ⅳ抑制率及氨基酸组成。氨基酸组成分析参考王俊强等[17]的方法，采用OPA FMOC柱前衍生，通过氨基酸自动分析仪进行测定。

1.2.6 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的稳定性分析

1.2.6.1 热稳定性

将核桃蛋白DPP-IV抑制肽溶于去离子水中配制成5 mg/mL的肽溶液，分别在37、50、60、70、80、90、100℃和121℃加热30 min后，冷却到室温，以未加热(25℃)的样品作为对照组，测定其DPP-Ⅳ抑制率，并表示为相对于对照组的活性。

1.2.6.2 pH稳定性

用2 mol/L HCl或NaOH将按1.2.6.1配制的5 mg/mL肽溶液的pH分别调节为1、3、5、7、9和11，在室温下孵育30 min。调节样品溶液pH至7.0，测定其DPP-Ⅳ抑制率，并表示为相对于对照组(未经任何处理)的活性。

1.2.6.3 体外模拟胃肠道消化稳定性

将按1.2.6.1配制的5 mg/mL肽溶液调节pH至2.0，加入2%胃蛋白酶，在37℃下孵育120 min，模拟胃消化。然后将混合物pH调节至6.8，加入2%胰酶，在37℃下孵育120 min，模拟肠消化。在体外消化过程中，分别在0、0.5、1、2、2.5、3、4 h取样，将取得的样品快速放入沸水浴中10 min，测定其DPP-Ⅳ抑制率。

1.2.7 数据处理

所有实验数据用SPSS Statistics Base 17.0和OriginPro 8.5分析处理。

2 结果与分析

2.1 核桃蛋白酶法水解条件的确定

2.1.1 蛋白酶的筛选

按照1.2.1方法，采用5种蛋白酶对核桃蛋白进行水解，对所得核桃蛋白水解物进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果见图1。

注：M.Marker；C.核桃蛋白；A、P、F、T、N分别为碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物。

由图1可看出，核桃蛋白在相对分子质量8.0～75.0 kDa范围内观察到13条明显的条带(泳道C)，不同蛋白酶水解过程中，高相对分子质量的条带被水解成低相对分子质量的新条带，核桃蛋白碱性蛋白酶水解物的蛋白条带降解最大，其次是复合蛋白酶水解物，而对于风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物，核桃蛋白条带都显示出较小的降解。

图2为核桃蛋白及其5种蛋白酶水解物(0.5 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制活性。

注：1、2、3、4、5分别为核桃蛋白碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物；不同字母表示有显著差异(P<0.05)。

由图2可看出，核桃蛋白表现出极低的DPP-Ⅳ抑制活性，DPP-IV抑制率小于5%，而5种蛋白酶水解物的DPP-Ⅳ抑制活性显著高于核桃蛋白。碱性蛋白酶水解物表现出最高的DPP-Ⅳ抑制活性，其次是胰蛋白酶水解物，二者无显著差异，但均显著高于复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶水解物，与Zhang等[5]报道的胰蛋白酶处理的牛/山羊酪蛋白水解物具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性结果一致。综上，选择碱性蛋白酶水解核桃粕。

2.1.2 水解时间的选择

按照1.2.1方法，采用碱性蛋白酶分别水解核桃粕1、2、3、4、5 h，测定不同水解时间下核桃蛋白水解度及水解物的DPP-Ⅳ抑制活性，结果见图3。

图3 不同水解时间下核桃蛋白水解度及水解物(0.5 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制率

由图3可看出，随着水解时间的延长，水解度增大，DPP-Ⅳ抑制活性不断提高，水解5 h时，核桃蛋白水解物的水解度、DPP-Ⅳ抑制率基本保持不变。因此，选择水解5 h的核桃蛋白碱性蛋白酶水解物进行后续研究。

2.2 核桃蛋白DPP-IV抑制肽的分离纯化

2.2.1 超滤分离组分的DPP-Ⅳ抑制活性

碱性蛋白酶水解物经超滤分离的3个不同相对分子质量肽组分的DPP-Ⅳ抑制活性如图4所示。

注：对照为碱性蛋白酶水解物。

由图4可看出，超滤获得的3个肽组分均表现出DPP-Ⅳ抑制活性，与核桃蛋白碱性蛋白酶水解物相比，5～10 kDa和小于5 kDa组分显示出更强的DPP-Ⅳ抑制活性，在0.25 mg/mL的质量浓度下其DPP-Ⅳ抑制率分别为28.65%和31.71%，而大于10 kDa组分与核桃蛋白碱性蛋白酶水解物没有显著差异。因此，将具有较高DPP-Ⅳ抑制活性的小于5 kDa组分冻干，用于SP Sephadex C-25阳离子交换层析进一步纯化。

2.2.2 阳离子交换层析各组分的DPP-IV抑制活性

采用1.2.5.2方法由碱性蛋白酶水解物小于5 kDa组分进一步分离得到的组分A和B的DPP-Ⅳ抑制活性测定结果见图5，氨基酸组成及含量见表2。

图5 阳离子交换层析各组分(0.25 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制率

由图5可看出，在0.25 mg/mL的质量浓度下，组分B的DPP-Ⅳ抑制率为76.19%，显著高于组分A(38.94%)，比未分离的碱性蛋白酶水解物的高约3倍。

表2 阳离子交换层析各组分的氨基酸组成及含量%

由表2可看出，碱性蛋白酶水解物的主要氨基酸是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸。碱性蛋白酶水解物、组分A和组分B含有的疏水性氨基酸比例分别为31.17%、33.85%和26.25%，酸性氨基酸比例分别为33.42%、40.97%和24.72%，碱性氨基酸比例分别为17.66%、7.47%和34.36%。与碱性蛋白酶水解物和组分A相比，组分B含有较高含量的碱性氨基酸，尤其是精氨酸。在阳离子交换过程中，带负电(Asp和Glu)的多肽未被吸附，带正电(Arg、His和Lys)的多肽吸附后被洗脱[18]，所以组分A含有高含量的酸性氨基酸，组分B含有大量碱性氨基酸。

综上，选择组分B作为最终的核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽并进行稳定性分析。

2.3 核桃蛋白DPP-IV抑制肽的稳定性

2.3.1 热稳定性(见图6)

图6 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的热稳定性

由图6可看出，分离纯化得到的DPP-Ⅳ抑制肽经过不同温度处理后，仍保持较高的DPP-Ⅳ抑制活性。值得注意的是，在80℃加热30 min，核桃肽的DPP-Ⅳ抑制活性提高了约4%，121℃处理30 min，DPP-Ⅳ抑制活性损失了约5%，结果表明核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽具有较好的热稳定性，可以应用到热处理食品中。

2.3.2 pH稳定性(见图7)

图7 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的pH稳定性

由图7可看出，在强酸(pH 1.0)和强碱(pH 11.0)条件下，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的DPP-Ⅳ抑制活性略有损失，这可能是由于抑制肽在酸性或碱性过强的条件下降解成非活性片段[19]。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的活性在pH 3.0～9.0范围内十分稳定，表明核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽可以应用到宽pH范围的食品体系中，并保留其生物活性。

2.3.3 体外模拟胃肠道消化稳定性(见图8)

图8 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的体外模拟胃肠消化稳定性

为了使生物活性肽在体内发挥其活性，要满足的要求之一是能抵抗胃肠道消化和降解的能力，通过肠道能够被完整吸收。体外模拟胃肠道消化可用于研究生物活性肽在体内的生物利用度。由图8 可看出，在胃环境中消化30 min，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的DPP-Ⅳ抑制率由76.19%降低至73.29%，但随着消化的继续进行，DPP-Ⅳ抑制活性有所提高，在十二指肠环境中，DPP-Ⅳ抑制活性继续提高并趋于稳定。我们推测在胃肠道消化后，可能产生了一些新的活性肽，这些肽具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性，因此DPP-Ⅳ抑制率有所增加。有研究报道，相对分子质量较小的短链肽通常对胃肠道酶具有抵抗力，对胃肠道消化实验显示出非常稳定的活性[20]。本研究结果表明，在模拟胃肠道消化过程中，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的活性结构并没有被胃肠道蛋白酶破坏，其活性得到很好的保留。

3 结 论

采用蛋白酶水解核桃粕中的蛋白质，经分离纯化得到DPP-Ⅳ抑制肽，研究了DPP-Ⅳ抑制肽的稳定性。结果表明，碱性蛋白酶水解物经过超滤和阳离子交换层析分离后得到的核桃蛋白DPP-IV抑制肽，在0.25 mg/mL的质量浓度下，DPP-Ⅳ抑制率为76.19%，其DPP-Ⅳ抑制活性在宽温度和pH范围内保持稳定，且在模拟胃肠道系统中，消化后的DPP-Ⅳ抑制活性有所提高。本文研究结果为食源DPP-IV抑制活性肽作为人体降血糖功能膳食的开发利用提供了基础。本课题组后续将进一步研究DPP-IV抑制肽结构与活性的关系，并评估其抑制模式和体内功效。