银杏与刺梨叶及杆中黄酮含量比较研究

李欣燃，田茹玉，陈胜贤，张华兴

（六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州六盘水 553004）

0 引言

黄酮类化合物（Flavonoids） 又称黄酮体，属于多酚类物质，在自然界中广泛存在，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、清热解毒、调节血脂和镇静等多种生物活性及保健功能[1-4]。用药历史达600 余年的银杏叶具有多种药理作用[5]，而黄酮是银杏叶中主要的生物活性成分之一，其在银杏叶中的含量是银杏叶采摘的重要指标。目前，对银杏叶中黄酮相关研究报道较多[6-7]，银杏叶也被公认为黄酮含量较多的植物，同时也是黄酮类化合物主要提取原料之一。

刺梨是缫丝花（Rosa Rosa roxburghiif.roxburghii） 的别名，又名黄金果或刺梨子，属于蔷薇科蔷薇属落叶灌木，主要分布于贵州、云南、四川等地，其中以贵州居多[8]。现代研究表明，刺梨具有延缓衰老[9]、抗肿瘤[10]、抗细胞凋亡和自噬[11-12]和延缓肾脏纤维化[13]等多种生物学活性，其所含有的黄酮类化合物是其发挥生物学活性的重要物质基础之一[14-16]。目前，对于刺梨叶的化学成分已有相关报道，而对于其生物活性的研究相对较少。尽管已有研究证明刺梨叶中含有丰富的黄酮类化合物，但是对于其含量还未有一个相对比较的标准。至于刺梨杆，其化学成分及生物活性更是未见报道。刺梨叶、刺梨杆在刺梨的培育过程中多作为废弃物处理，为探明刺梨叶、刺梨杆中总黄酮含量，确定刺梨叶、刺梨杆进一步的开发利用价值，以银杏叶、杆为参照，对刺梨叶、杆中黄酮含量进行检测分析，旨在为进一步开展刺梨叶、杆有效成分生物活性分析积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

银杏叶、银杏杆、刺梨叶、刺梨杆，均采自贵州省六盘水市六盘水师范学院，采摘后通风放置1 周，于80 ℃下烘干备用。

1.2 测定样品液制备

将烘干处理后的银杏叶、银杏杆、刺梨叶、刺梨杆分别置于研钵中研至粉末，精确称取各样品1 g，按料液比1∶50 加入80%乙醇，放置80 ℃水浴锅中加热2 h，以转速3 000 r/min 离心10min，取上清液待测。

1.3 芦丁标准品制备

精确称取芦丁标准品10 mg 于50 mL 容量瓶中，加入80%乙醇定容，摇匀，使其完全溶解，即得0.2 g/L 芦丁标准液；取10，8，6，4，2 mL 于25 mL 容量瓶中，加80%乙醇至10 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀后，放置室温6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀后，室温放置6 min，加入4% NaOH 溶液10 mL，用80%乙醇溶液稀释至25 mL，得芦丁对照液，放置室温15 min，于波长510 nm 处测其吸光度。

1.4 总黄酮含量检测

采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法[17]，测得各提取液中黄酮含量，分别取4 种待测液各1 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入80%乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后放置室温6 min；加10% Al(NO3)3溶液1 mL，混匀后室温放置6 min；加4% NaOH 溶液10 mL，以80%乙醇定容至25 mL，混匀，放置室温15 min，于吸光度最大的510 nm 处测定其吸光度，每个样品重复测定3 次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.5 精密度和重复性试验

制备刺梨叶总黄酮提取液，平行试验5 份，按照Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法检测计算总黄酮含量及相对标准偏差（RSD），每份样品重复测定5 次。

1.6 稳定性试验

取刺梨叶总黄酮提取液，检测时间为提取后0和30 min，按照Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法测定其吸光度，重复5 次，计算分析其总黄酮含量的变化。

1.7 数据分析

试验数据处理采用Prism5 软件，各组样品中总黄酮含量采用配对T 检验法进行分析，若p 值≤0.05，则表示具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准工作曲线

以芦丁标准品对照液质量浓度为横坐标X，以吸光度为纵坐标Y，绘制芦丁标准曲线。并进行线性拟合，得到线性回归方程：Y=1.301X+0.050，R2=0.990。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

由图1 可知，芦丁溶液质量浓度为0.2～0.8 mg/mL时呈现良好的线性关系。

2.2 不同样品中总黄酮提取含量比较

不同样品中总黄酮含量的比较见表1。

表1 不同样品中总黄酮含量的比较/mg·g-1

由表1 可知，刺梨叶、杆样品与银杏叶、杆样品中黄酮含量差异显著，变化幅度从1.91 mg/g 至9.87 mg/g，其中刺梨叶和刺梨杆提取液中总黄酮含量较高，分别为9.87 mg/g 和9.08 mg/g，银杏杆中黄酮含量最低，仅为1.91 mg/g。

不同部位黄酮含量见图2。

图2 不同部位黄酮含量

由图2 可知，刺梨的各部分总黄酮含量显著高于银杏相应部位含量，且p＜0.001；刺梨叶和刺梨杆总黄酮含量无显著性差异；刺梨杆总黄酮含量显著高于银杏叶黄酮含量，p＜0.05；而银杏叶总黄酮含量显著高于其杆部黄酮含量，p＜0.001。

2.3 精确度和重复性检测结果

取刺梨叶提取其总黄酮含量，做5 个平行试验。相对标准偏差为6.47% ，说明采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法测定样品总黄酮含量的方法可行性好、精确度高、重复性好。

精确度和重复性检测结果见表2。

表2 精确度和重复性检测结果

2.4 稳定性检测结果

将刺梨叶总黄酮提取液经显色反应后于室温放置30 min，分别测定0 和30 min 后刺梨叶总黄酮提取液含量。再将提取液于4 ℃放置30 min 后，刺梨叶中提取的总黄酮含量明显降低为原来的85.67%，提取液中黄酮含量下降差异显著（见图3），表明提取液经显色反应后稳定性较差，试验中需尽快完成检测。

稳定性检测结果见表3，刺梨叶总黄酮提取液稳定性检测见图3。

表3 稳定性检测结果

图3 刺梨叶总黄酮提取液稳定性检测

3 结论

黄酮类化合物是植物体内重要的代谢产物，对人体健康具有重要价值[18-19]。为此，寻找黄酮含量丰富的植物体对其进行生物活性研究已是国内外科学工作者的研究热点之一。刺梨首载于《本草纲目拾遗》[20]，属于传统中药，具有多种药理作用。已有研究证明刺梨果中含有丰富的黄酮类化合物，而且这类物质是刺梨果发挥生物活性的基础成分之一。鉴于此，推测刺梨的叶和杆中应含有丰富的黄酮类物质，研究目的之一即是探明刺梨叶和杆中黄酮化合物含量。银杏叶因其多种药理作用而被人所重视，并已得到很好的研究开发应用，其中黄酮即是银杏叶发挥药理活性的主要有效成分之一，同时在银杏叶中，黄酮化合物含量高也为人所熟知。以银杏叶为参照，对银杏杆、刺梨叶、刺梨杆中黄酮含量进行检测，以期确定银杏杆、刺梨叶和刺梨杆的开发利用价值。

采用紫外分光光度比色法，分别对银杏叶、银杏杆、刺梨叶和刺梨杆中总黄酮含量进行测定。此方法操作及样品处理相对简便，精密度高、重复性好[17，21]，可方便快速地对银杏及刺梨叶和杆中总黄酮含量进行测定。试验结果表明，对于银杏而言，叶片中黄酮含量远远高于杆中黄酮含量，说明银杏杆的开发利用价值不高；而对于刺梨，叶片和杆之间的黄酮含量差异不大，同时其黄酮含量显著高于银杏叶中黄酮含量，说明刺梨的叶、杆均具有较大的开发利用价值。