鸡蛋清水解物对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼的改善作用

王 玉，刘采云

（1.厚德食品股份有限公司上海第一分公司，上海 201100；2.上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200082）

疲劳是持久或过度劳累后造成的身体不适及工作效率减退的现象[1]。长期以来，众多学者期望能寻找到一种安全、有效、无毒副作用的方法来有效延缓疲劳的发生和加速疲劳的消除[2]。

鸡蛋清蛋白质氨基酸模式与人体最接近，生物利用率高，被认为是蛋白质的理想来源。蛋清蛋白经过一种或多种酶水解后形成具有生物活性的肽段，可在食品工业和医药行业方面发挥极大作用[3-4]。目前，发现的鸡蛋中的生物活性肽包括降血压肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫调节肽和促进脑部健康肽等[5-9]。

斑马鱼是一种新型模式脊椎动物，具有繁殖能力强、生殖周期短、胚胎透明、能在显微镜下进行实时观察等特点。其基因与人类基因有着87%的相似性，它们的编码蛋白结构相似而且在生物体内发挥类似的功能，被美国食品药品监督管理局列为继人和啮齿类鼠之后的第三大模式生物，已广泛应用于生命科学研究[10-11]。

利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离，以统计学意义确定了HEpep 对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用，旨在探索鸡蛋清水解物的新的应用方向。

1 材料与方法

1.1 原料

斑马鱼（野生AB 系）；HEpep，厚德食品股份有限公司提供；亚硫酸钠、NaOH 溶液、柠檬酸，阿拉丁试剂（上海） 有限公司提供；中华跌打丸，广西梧州制药（集团） 股份有限公司提供；乳酸测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 主要仪器设备

V3 行为分析仪，ViewPoint Life Sciences 产品；SPX-250B-Z 型生化培养箱，博迅实业有限公司产品；Waters 1525 型高效液相色谱仪、L-8900 型全自动氨基酸分析仪，日本日立公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 HEpep 的制备工艺

HEpep 制备工艺：蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分离→浓缩喷雾干燥→蛋清蛋白肽。

1.3.2 HEpep 分子量大小的测定

HEpep 分子量大小的测定采用Waters 1525 高效液相色谱仪（配2487 紫外检测器和Empower 工作站GPC 软件），色谱柱为TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流动相为乙腈/ 水/ 三氟乙酸= 45/55/0.1（V/V/V），检测波长为220 nm，流速为0.5 mL/min，柱温为30 ℃。

1.3.3 HEpep 氨基酸含量的测定

氨基酸含量选用日立L-8900 全自动氨基酸分析仪测定。

1.3.4 斑马鱼仔鱼的准备

斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L 反渗透水中加入200 mg 速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm，pH 值为6.9～7.2，硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3），试验动物使用许可证号为：SYXK（浙） 2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC 认证的要求。

野生型AB 品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每试验组为30 尾，用于确定HEpep 抗疲劳作用的最大检测浓度（MTC）。野生型AB 品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每试验组为30 尾，用于HEpep 抗疲劳作用评价。

1.3.5 确定HEpep 的最大检测浓度（MTC）

随机选取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB品系斑马鱼，每孔（试验组） 均处理30 尾斑马鱼，分别水溶给予HEpep 质量浓度250，500，1 000，2 000，4 000 μg/mL，同时设置正常对照组（即养鱼用水处理斑马鱼），每孔（试验组） 容量为5 mL，置于28 ℃培养箱中培养1～5 d。试验结束后，观察记录斑马鱼的死亡数量和毒性情况，确定HEpep 对斑马鱼的最大检测浓度（MTC）。

1.3.6 HEpep 对斑马鱼运动的影响

随机选取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB 品系斑马鱼，每孔（试验组） 均处理30 尾斑马鱼，分别水溶给予HEpep 质量浓度111，333，1 000 μg/mL，阳性对照药中华跌打丸1 mg/mL，同时设置正常对照组（即养鱼用水处理斑马鱼） 和模型对照组，每孔（试验组） 容量为5 mL。28 ℃培养箱中培养1～5 d后，除正常对照组外，其余试验组均用8 mg/mL 亚硫酸钠处理5 d 斑马鱼20 min，以诱发斑马鱼疲劳模型。

HEpep 和亚硫酸钠共同处理斑马鱼20 min 后，每个试验组随机选取10 尾斑马鱼，利用行为分析仪，测定斑马鱼的运动总距离（S），以统计学意义评价HEpep 对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用。

HEpep 对斑马鱼运动能力改善作用计算公式如下：

式中：S——供试品组；

SM——模型对照组；

SC——正常对照组

1.3.7 运动后斑马鱼乳酸含量测定[12]

乳酸测试盒按步骤加样后，采可见光分光光度计测其吸光值（波长530 nm），制作乳酸含量的标准曲线。在低温环境中，将运动后的模型斑马鱼、阳性对照组（用中华跌打丸处理） 和HEpep 3 个质量浓度（111，333，1 000 μg/mL） 处理后的斑马鱼用10倍生理盐水制成匀浆液，离心后取上清液稀释5 倍后测其吸光值（波长530 nm），通过标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度（mmol/L），换算后即得斑马鱼体内乳酸浓度。

1.3.8 数据处理

用方差分析和Dunnett's T- 检验进行统计学分析，p＜0.05 表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 HEpep 的分子量

HEpep 的凝胶渗透色谱图见图1，HEpep 的凝胶渗透色谱分析结果见表1。

图1 HEpep 的凝胶渗透色谱图

表1 HEpep 的凝胶渗透色谱分析结果

从表1 可知，分子量为668，303 的肽段含量最大，分别占25.22%，48.05%。

2.2 HEpep 的氨基酸含量检测结果

HEpep 的氨基酸含量检测结果见表2。

对鸡蛋清水解物HEpep 的氨基酸含量进行分析可以看出，HEpep 中必需氨基酸占氨基酸总量的36%，而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56 倍。根据FAO/WHO，理想蛋白模式中，必需氨基酸含量应该占氨基酸总量的40%左右，且必需氨基酸含量应是非必需氨基酸含量的0.60 倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO 对理想蛋白质的规定，而且HEpep 中氨基酸含量高达127.68 mg/g，说明HEpep 可以作为一种理想的蛋白质来源。另外，HEpep 中支链氨基酸（亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸）的含量高达15.93 mg/g。

表2 HEpep 的氨基酸含量检测结果

2.3 HEpep 质量浓度对斑马鱼死亡率的影响

HEpep 处理后斑马鱼“质量浓度-死亡率”试验结果（n=30） 见表3。

表3 HEpep 处理后斑马鱼“质量浓度-死亡率”试验结果（n=30）

表3 表明了HEpep 处理后斑马鱼“质量浓度-死亡率”的试验结果。由表3 可知，HEpep 在250～1 000 μg/mL 下，未引起斑马鱼死亡，也未见其他明显的毒性表型；然而在2 000 和4 000 μg/mL 下，分别诱发11/30 和30/30 尾斑马鱼死亡，死亡率分别为36.7%和100%，故确定HEpep 对斑马鱼抗疲劳作用的最大检测质量浓度为1 000 μg/mL，因此抗疲劳作用正式试验质量浓度设置为111，333，1 000 μg/mL。

2.4 HEpep 的抗疲劳作用评价

亚硫酸钠可以与水中的溶解氧发生反应，造成环境中缺氧，斑马鱼在缺氧环境中造成疲劳，因此常用于疲劳造模[13]。运动耐力试验是反映机体疲劳最直接、最客观的指标，是机体运动过程中物质代谢和能量代谢的综合体现[14]。

HEpep 对疲劳斑马鱼运动能力的影响（n=10）见表4，HEpep 对疲劳斑马鱼体内乳酸含量的影响(p＜0.05)（n=10） 图2。

表4 HEpep 对疲劳斑马鱼运动能力的影响（n=10）

图2 HEpep 对疲劳斑马鱼体内乳酸含量的影响(p＜0.05)（n=10）

阳性对照药中华跌打丸由金不换、半边莲等数十种中草药组成，具有消肿止痛、舒筋活络、止血生肌、活血驱风的功效[15]。从表4 可知，模型对照组斑马鱼总运动距离（2 622 mm） 与正常对照组（6 505 mm） 比较，说明疲劳斑马鱼模型构建成功；阳性对照药中华跌打丸组（1 mg/mL） 斑马鱼总运动距离为7 097 mm，与模型对照组比较其运动改善作用为115.2%。根据图2 所示，中华跌打丸组斑马鱼运动后体内乳酸含量最低（0.003 mmol/g），与模型对照组比较（乳酸含量0.092 mmol/g），乳酸含量降低97%，说明中华跌打丸可显著改善亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力，降低体内乳酸含量。此结果与高华等人[15]的研究结果一致，中华跌打丸能明显延长小鼠负重游泳时间，降低运动后血清尿素氮的含量，加快运动后血清乳酸的消除速率，对缓解机体运动中的疲劳感有积极的作用[16]。

HEpep 质量浓度111，333，1 000 μg/mL 组斑马鱼总运动距离分别为5 439，3 280，2 697 mm，与模型对照组（2 622 mm） 比较，其运动改善作用分别为72.5%，16.9%，1.9%，HEpep 处理后斑马鱼运动后体内乳酸含量分别为0.034，0.075，0.087 mmol/g（见图2），与模型对照组比较，乳酸含量分别降低63.2%，18.8%，5.1%。说明在试验质量浓度条件下，HEpep 对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用，而且当HEpep 质量浓度为111 μg/mL时，该作用最明显，乳酸含量降低率也最大。当HEpep质量浓度大于111 μg/mL 时（333 和1 000 μg/mL），对疲劳斑马鱼运动改善作用呈现减弱趋势，运动后斑马鱼体内乳酸累积量也呈现上升趋势。该结果提示HEpep 作为疲劳改善剂使用时，适宜质量浓度范围为0～111 μg/mL，并非剂量越大越好。根据HEpep的GPC 分子量分析结果显示，分子量668，303 的肽段占比最大，分别占25%，48%。研究发现，小分子肽在人体不需消化可直接吸收，能直接参与蛋白质的合成[17]。蛋清蛋白通过酶解作用也可产生具备抗氧化活性的氨基酸，包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等[18]，可清除体内超氧阴离子和羟基自由基（·OH），维持机体氧化还原平衡[19]，降低疲劳感。根据表2 结果可知，HEpep 中具有抗疲劳功效的支链氨基酸（亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸） 含量高达15.93 mg/g，可能是HEpep 对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用的原因。

3 结论

鸡蛋清水解物HEpep 中支链氨基酸（亮氨酸+异亮氨酸+ 缬氨酸） 含量丰富，高达15.93 mg/g。对于亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼，在111，333，1 000 μg/mL 的质量浓度条件下，其运动改善作用分别为72.5%，16.9%，1.9%，乳酸含量分别降低63.2%，18.8%，5.1%。HEpep 对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用，HEpep 作为疲劳改善剂使用时，适宜质量浓度范围为0～111 μg/mL。