熊果酸预处理对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌病理改变的影响

王金艳 肖亚利 陈丽东 宋 红 赵 敏 王国龙

急性心肌梗死(acute myocadical infraction，AMI)是临床上较为常见的急危重症和心源性猝死的主要原因，具有起病急、病情进展迅速的特点，多数患者无法在最佳治疗时间窗内得到有效救治，因此研发出能够有效缓解AMI疾病进展的药物将具有重要的临床意义[1]。熊果酸(ursolic acid，UA)是天然存在于杜鹃花科灌木熊果中的一种五环三萜类化合物，能够通过抑制钙超载对缺血性脑损伤起到保护作用，而钙超载是AMI后心肌组织和细胞不可逆损伤的重要病理机制[2,3]。因此本研究通过造模前3天开始给予UA预处理，并以钙通道阻断剂维拉帕米(verapami，Ver)为阳性对照药物，研究UA对AMI后心功能及心肌组织病理改变的影响。

材料与方法

1.材料：(1)药物与试剂：UA购自上海玉博生物科技有限公司(纯度≥98%)；Ver购自黑龙江多多药业有限责任公司(规格2ml:5mg)；NBT购自上海前进试剂厂；TUNEL试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司。(2)实验动物：180只SPF级雄性SD大鼠，体质量230±20g，购自河北省实验动物中心[实验动物许可证号：SCXK(冀)2018-004]，适应性饲养7天后进行实验(亮暗时间1∶1、室温25±1℃、相对湿度65%±5%)。

2.动物分组、给药预处理与造模：(1)分组与给药预处理：180只大鼠数字编码后按照数字表法随机分为假手术组(Sham组)，AMI组，UA低、中、高剂量(10、20、40mg/kg)组和Ver(2.5mg/kg)预处理组，每组30只。精确称取UA并加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度10、20、40mg/ml的UA溶液；UA低、中、高剂量预处理组分别于造模前3天开始1次/天腹腔注射给予10、20、40mg/ml的UA溶液，Ver预处理给予Ver溶液，Sham组和AMI组给予0.9%氯化钠溶液，注射剂量均为1ml/kg。(2)造模：参照吴庆景等[4]报道的方法，通过结扎左冠状动脉前降支复制AMI大鼠模型；结扎后左心室心肌苍白，心电图ST段持续抬高或T波高耸即可判断造模成功。假手术组除不结扎左冠状动脉前降支外，其余操作同AMI组。

3.心功能指标和心肌梗死体积检测：①每组随机取10只大鼠，通过心脏超声多普勒检测左心室舒张、收缩末期内径(LVIDd、LVIDs)、射血分数(EF)和每搏排出量(SV)，连续检测5个心动周期取平均值；②颈椎脱臼处死，取心脏置-20℃冰箱冻存0.5h，取左心室并沿房室沟方向平行切为5片，置2% NBT溶液37℃避光孵育1h，通过图像分析系统计算心肌梗死体积。

4.心肌组织病理学检查及评分：每组大鼠按照数字表法随机取10只，麻醉后开胸，取心脏组织并切取左心室，置4%多聚甲醛溶液固定72h后行石蜡包埋、4μm厚度切片、二甲苯透明、梯度乙醇脱蜡后，行HE染色，通过光学显微镜观察心肌组织病理学改变。损伤评分：由两名实验人员参照叶兰等[5]报道的方法独立评分后取平均值：正常心肌计0分，病变视野比例≤1/4计1分、1/4～1/2计2分、≥1/2计3分，从变性坏死、出血、间质水肿、炎性细胞浸润4方面评分，总和即为损伤评分。

5.细胞凋亡检测：石蜡切片经二甲苯透明和梯度乙醇脱蜡水化处理后，参照TUNEL试剂盒说明进行染色处理，通过光学显微镜观察细胞凋亡状况。凋亡指数(apoptosis index, AI)计算：每张切片分别由两名实验人员随机取5个不重叠视野计数凋亡细胞数和细胞总数，AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

6.心肌细胞超微结构检测：各组取剩余的10只大鼠，颈椎脱臼处死后开胸取心脏，取左心室并切割成5mm3方块，4%戊二醛溶液4℃固定24h、1%锇酸4℃固定3h，梯度乙醇和无水丙酮脱水、氧化丙烯置换和环氧树脂包埋后，70nm厚度超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重电子染色后通过透射电子显微镜观察细胞超微结构。

结 果

1.各组大鼠心功能指标比较：与Sham组比较，AMI组大鼠LVIDd、LVIDs显著升高而EF、SV显著降低(P<0.01)；与AMI组比较，UA中、高剂量和Ver预处理组LVIDd、LVIDs降低且EF、SV升高(P<0.05或P<0.01)；与Ver预处理组比较，UA高剂量预处理组LVIDs降低且SV升高(P<0.05或P<0.01,表1)。

表1 各组大鼠心功能指标比较

2.各组大鼠心肌梗死体积比较：与Sham组比较，AMI组心肌梗死体积显著升高(P<0.01)；与AMI组比较，UA中、高剂量和Ver预处理组梗死体积降低(P<0.01)；与Ver预处理组比较，UA高剂量预处理组梗死体积降低(P<0.01，表2)。

表2 各组大鼠心肌梗死体积、损伤评分、AI比较

3.各组大鼠心肌组织病理学改变及损伤评分比较：Sham组大鼠左心室心肌组织形态结构未见异常；AMI组呈现心肌纤维部分断裂，细胞数量减少、排列紊乱，胞核固缩、偏移，间质水肿，大量炎性细胞浸润等病理改变；与AMI组比较，UA各剂量和Ver预处理组上述形态结构改变呈不同程度减轻，其中UA高剂量预处理组未见心肌纤维断裂、间质水肿不明显。与Sham组比较，AMI组大鼠心肌损伤评分显著升高(P<0.01)；与AMI组比较，UA中、高剂量和Ver预处理组损伤评分降低(P<0.05或P<0.01)；与Ver预处理组比较，UA高剂量预处理组损伤评分降低(P<0.05,图1,表2)。

4.各组大鼠心肌细胞凋亡比较：Sham组心肌可见少量凋亡细胞；与Sham组比较，AMI组凋亡细胞数量明显增多、AI显著升高(P<0.01)；与AMI组比较，UA低、中、高剂量和Ver预处理组凋亡细胞数量明显减少，AI降低(P<0.01)；与Ver预处理组比较，UA高剂量预处理组AI降低(P<0.01,图2,表2)。

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变比较(HE，×200)A.Sham组；B.AMI组；C.UA低剂量预处理组；D.UA中剂量预处理组；E.UA高剂量预处理组；F.Ver预处理组

5.各组大鼠心肌细胞超微结构改变比较：Sham组染色质分布均匀、线粒体结构清晰，未见异常；AMI组呈现平滑肌丝溶解断裂，染色质固缩，核仁边界不清，线粒体膜破裂、嵴变短、嵴溶解消失等超微结构病变；UA各剂量和Ver预处理组上述超微结构病变呈不同程度减轻，其中UA高剂量预处理组心肌纤维少量断裂，染色质分布均匀，线粒体结构完整,详见图3。

讨 论

随着人民生活水平的提高以及人口老龄化的加剧，AMI发生率呈逐年上升趋势[6]。近年来中医药防治AMI得到广泛关注，熊果酸是可药用植物熊果的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性[7～9]，而氧化应激、炎性反应以及继发性细胞凋亡在AMI病理变化过程中发挥着重要作用[10～12]。本研究结果显示，经UA预处理能够明显降低AMI大鼠LVIDd、LVIDs并升高EF、SV，降低左心室心肌梗死体积；明显改善心肌纤维断裂，胞核固缩、偏移，间质水肿，炎性细胞浸润等病理性改变，并且UA高剂量预处理组作用优于Ver预处理组，提示UA预处理对AMI大鼠心功能和心肌病理学改变具有保护作用。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡比较(TUENL，×400)A.Sham组；B.AMI组；C.UA低剂量预处理组；D.UA中剂量预处理组；E.UA高剂量预处理组;F.Ver预处理组

图3 各组大鼠心肌细胞超微结构改变比较(透射电子显微镜，×10000)A.Sham组；B.AMI组；C.UA低剂量预处理组；D.UA中剂量预处理组；E.UA高剂量预处理组;F.Ver预处理组

心肌细胞具有不可再生性，因此挽救心肌梗死区半暗带细胞是改善AMI患者预后的关键[13]。细胞凋亡是一种程序化自主死亡过程，对维持生理状态下细胞新陈代谢具有重要作用，但病理性刺激心肌细胞过度凋亡在AMI疾病进展过程中发挥着重要作用[14,15]。线粒体膜通透性改变导致细胞色素C释放入细胞质，将启动线粒体介导的内源性凋亡途径[16，17]。本研究发现，AMI大鼠左心室心肌细胞凋亡数量明显增多，与张显纯等[18]、袁辉等[19]研究结果一致；梗死区心肌细胞呈现肌丝溶解断裂，线粒体膜破裂、嵴断裂溶解等超微结构病变，与张丽丽等[20]研究结果一致。经UA预处理能够明显抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡并降低AI，抑制心肌细胞线粒体细胞器等超微结构病变，UA高剂量预处理组上述作用优于Ver预处理组，提示UA对AMI大鼠心肌细胞凋亡和细胞超微结构病变具有抑制作用。

综上所述，UA预处理对AMI大鼠心功能和左心室心肌病理学改变及细胞超微结构病变具有保护作用，但其作用机制还有待于进一步研究。