HMGB1 对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用

余良飞

高迁移率族蛋白（high-mobility group box，HMGB）属于高迁移率族蛋白超家族成员，是一种广泛存在于真核细胞中的非组蛋白的核DNA 结合蛋白，其家族成员均具有典型的HMG 核[1]。目前，在哺乳动物中已发现了HMGB1、HMGB2、HMGB3 等成员，它们多分布于细胞核中[2]。HMGB1 作为一种高度保守的核结合蛋白，其参与了基因的重组、调节基因的转录，并在细胞增殖分化、肿瘤细胞的迁移及炎症损伤等过程中起着重要作用[3]。研究表明，HMGB1 表达受抑制后，端粒的稳态被破坏，进而抑制了DNA 损伤的修复，从而提高了乳腺癌细胞的敏感性[4]。因此，HMGB1 可能是乳腺癌化疗敏感性的关键基因之一。为了探究HMGB1 在乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭过程中的作用，本文采取了外源HMGB1刺激乳腺癌细胞株MDA-MB-453，现报道如下研究结果。

1 材料与方法

1.1 一般资料

细胞株和主要试剂：人乳腺癌细胞株MDA-MB-453 购自中科院上海细胞库，L15 基础培养基购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司，青霉素-链霉素混合液购自美国Hyclone公司，Matrigel 和24 孔板小室购自美国康宁公司，CCK-8 试剂盒和二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）购自美国Sigma公司，重组HMGB1 购自美国R&D 公司。细胞培养：将冻存的MDA-MB-453 细胞常规复苏重悬后，采用L15 完全培养基（含10% FBS，100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素），置于37 ℃、含5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，第二日更换1 次培养基，之后每3 天更换1 次。当细胞融合度达到80%～90%时取最好状态的细胞用于后续实验。细胞传代时，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min，后加入2 mL 的完全培养基终止消化后，1 000 r/min离心3 min，弃上清收集沉淀细胞，用完全培养液重悬制成新细胞悬液后按所需比例传代或接种。

1.2 研究方法

细胞增殖活性检测：试验设置空白组和药物组，药物组分别用100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL 的重组HMGB1刺激MDA-MB-453 细胞株。待细胞密度达80%～90%时，将细胞消化计数，按照密度为0.8×105个/mL 的密度接于96 孔板中，放入培养箱中培养12 h，按照上述分组将药物加入96 孔板中，每组设置8 个复孔，加入药物后接着培养48 h。培养48 h 向每孔中加入10 μL CCK，37 ℃培养4 h，然后在450 nm 处测定其吸光度，每组8 个复孔，测定重复3 次。

细胞划痕试验：试验设置空白组和药物组，药物组为400 ng/mL 的重组HMGB1 刺激MDA-MB-453 细胞株。细胞消化、计数后，按5×105的密度接种到6 孔板中培养。当细胞密度达到80%～90%时，用200 μL 的枪头，在板盖进行划痕（划痕时动作要轻，既要保证划痕的质量，又不能破坏细胞）；划痕后拍照，记录划痕0 h 细胞状态（每个孔都要记录）；拍照后吸掉原有培养基，加1 mL PBS 清洗细胞两遍；然后向板中加入配好的含有药物的培养基（注意要标记好每孔的药物浓度）；最后放入37 ℃，含5%CO2的培养箱中培养，在12 h、24 h 和48 h 采用倒置显微镜观察、拍照。采用Image-Pro plus 6.0 软件对迁移距离进行分析。

细胞迁移率=（0 h 划痕宽度-培养后划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%

Transwell 检测细胞侵袭水平：试验设置空白组和药物组，药物组为400 ng/mL 的重组HMGB1 刺激MDA-MB-453 细胞株。在小室中提前铺设Matrigel 胶，将1×104个细胞加入血清培养基的上室，下室为含10%胎牛血清的培养基。24 h 后取出小室，依次经甲醛固定和结晶紫染色，采用倒置显微镜计算侵袭细胞数。

1.3 观察指标

100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL 和800 ng/mL 的外源HMGB1对MDA-MB-453 乳腺癌细胞增殖影响；400 ng/mL 的外源HMGB1对MDA-MB-453 乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 进行数据分析，数据以（±s）表示，不同剂量的HMGB1 处理组采用单因素方差分析，均数两两比较采用配对t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源HMGB1 刺激对乳腺癌细胞增殖的影响

与空白组相比，不同剂量组的外源HMGB1 刺激MDAMB-453 乳腺癌细胞48 h 后，MDA-MB-453 细胞增殖均明显升高（P＜0.05）；100 ng/mL 和200 ng/mL 外源HMGB1 刺激的细胞增殖存在差异（P＜0.05），但200 ng/mL、400 ng/mL 与800 ng/mL 组间细胞增殖则无明显差异（P＞0.05）（图1）。

图1 不同剂量HMGB1 对乳腺癌MDA-MB-453 细胞增殖的影响

2.2 外源HMGB1 刺激对各组乳腺癌细胞迁移的影响

采用细胞划痕试验检测外源HMGB1 刺激后乳腺癌细胞的迁移，结果显示，经400 ng/mL 的HMGB1 处理48 h 后，细胞的迁移明显增强（P＜0.01），且呈时间依赖性（图2）。

2.3 外源HMGB1 刺激对各组乳腺癌细胞侵袭的影响

采用Transwell 法检测400 ng/mL 外源HMGB1 处理24 h 后MDA-MB-453 细胞的穿膜数量，发现HMGB1 处理的加药组细胞穿膜数量高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3）。

3 讨论

HMGB1 作为比较保守的高迁移率族蛋白家族成员，其含有2个与DNA 结合的结构域和1 个可以调控基因转录的C 端，参与多种炎症因子的释放[5]。研究表明HMGB1 在细胞的分化增殖和迁移侵袭中也发挥着重要作用[6]，此外HMGB1 作为一种凋亡和自噬调节因子，其在肿瘤的发生发展中也发挥重要功能[7]。已有研究表明HMGB1 参与了结直肠癌[8]、肝癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]等肿瘤细胞的凋亡、迁移和侵袭过程，影响肿瘤细胞释放免疫因子。Huang BF 等[12]研究发现HMGB1 在乳腺癌组织表达明显升高，这表明HMGB1 在乳腺癌的发生、发展中可能起重要作用。

图2 外源HMGB1 刺激对各组乳腺癌细胞迁移的影响

图3 外源HMGB1 刺激对各组乳腺癌细胞侵袭的影响

本研究中，不同剂量的外源HMGB 刺激乳腺癌MDA-MB-453细胞后，采用CCK-8 检测细胞增殖情况，与空白组相比，不同剂量组的外源HMGB1 刺激MDA-MB-453 乳腺癌细胞48 h 后，MDA-MB-453 细胞增殖均明显升高（P＜0.05）；100 ng/mL 和200 ng/mL 外源HMGB1 刺激的细胞增殖存在差异（P＜0.05），但200 ng/mL、400 ng/mL 与800 ng/mL 组间细胞增殖则无明显差异（P＞0.05）；由此可见在较低剂量（＜200 ng/mL）情况下，细胞增殖随HMGB1 剂量的增加而增强，当剂量＞400 ng/mL 时，细胞增殖增加不明显，说明HMGB1 对乳腺癌细胞增殖的促进作用不具有剂量依赖性。采用细胞划痕试验检测外源HMGB1 刺激后乳腺癌细胞的迁移，结果显示，经400 ng/mL 的HMGB1 处理48 h 后，细胞的迁移明显增强（P＜0.01），且呈时间依赖性。采用Transwell 法检测400 ng/mL 外源HMGB1 处理24 h 后MDAMB-453 细胞的穿膜数量，发现HMGB1 处理的加药组细胞穿膜数量高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

综上所述，研究结果表明HMGB1 在乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭方面起着促进作用，这一结果对乳腺癌的治疗提供了新的思路。