绿豆抗性糊精的高效纯化技术及分子特性研究

李良玉 刘晚霞 李朝阳 牛广财*

（1 黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心 黑龙江大庆163319 2 东北林业大学林学院 哈尔滨150040 3 黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江大庆163319）

抗性糊精是由淀粉加工而成的一种新型的水溶性膳食纤维，具有低黏度，低热量，难消化，稳定性良好等特性[1-3]，具有降低血糖，整理肠道，调节血脂，促进消化道益生菌生长繁殖等作用[4-7]，在食品加工中具有广阔的发展前景。很多专家学者、科研人员投身于抗性糊精的制备与纯化研究中[8-14]，然而由于各种原因均难以进行工业化生产。本研究采用国际上先进的模拟移动色谱技术纯化抗性糊精，旨在探索模拟移动色谱高效纯化抗性糊精的方法，为抗性糊精的产业化生产奠定基础。此外，由于不同淀粉的单糖组成、含量及连接方式不同，制备得到的抗性糊精的分子特性也不尽相同，以绿豆淀粉为原料，对纯化后的绿豆抗性糊精进行分子特性分析，为抗性糊精的分子合成机制、构效关系机制等研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆淀粉原料，烟台双塔食品有限公司；强酸性阳离子凝胶型色谱树脂CSR-3K+，淄博东大化工股份有限公司；单糖标准品，美国Sigma-Aldrich公司。

6890N/MSD5973 GC-MS 分析仪，美国Agilent 公司；高效尺寸排阻色谱-十八角激光光散射仪-示差折光检测器联用系统，美国Wyatt 公司；尺寸排阻色谱柱 （TSK G5000 PW 7.5 mm × 600 mm），日本TOSOH 公司；RPL-ZD10 液相色谱分析型裝柱机，大连日普利科技仪器有限公司；制备色谱系统、顺序式模拟移动色谱分离实验设备（SSMB-6Z6L 型），国家杂粮工程技术研究中心制造；1200s 液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 绿豆抗性糊精制备方法 工艺流程：绿豆淀粉→烘干→酸处理→热解→冷却溶解→液化→糖化→脱色→脱盐→浓缩。

称取一定量的淀粉烘干至含水量5%以下，喷雾加1%的盐酸，加酸量为体积分数7%，于干燥箱中90 ℃预干燥1 h，然后在160 ℃下热解2 h，热解结束后取出自然冷却。将热解产物加3 倍体积的水制成30%溶液，用1 mol/L NaOH 溶液调pH值为6.0，加入耐高温α-淀粉酶质量分数0.5%在95 ℃反应2 h，然后调pH 值至4.5，加质量分数0.6%糖化酶糖化2 h，反应结束后灭酶，过滤。采用活性炭脱色，阴阳离子色谱脱盐，真空浓缩，得到绿豆抗性糊精制备液[15]。

1.2.2 树脂预处理与装填方法 称取200 mL CSR-3K+树脂用去离子水反复冲洗，去除破损树脂及加工过程中的杂质，用去离子水浸泡过夜，采用液相色谱装柱机进行树脂装填，装填后用去离子持续冲洗，直至流出液的电导与去离子水一致，期间不断升温至60 ℃，树脂装填完成后备用。

1.2.3 制备色谱评价试验 在前期研究的基础上，按照进料折光率60%，进料9 mL，柱温60 ℃，洗脱流速1.6 mL/min 做制备色谱分离试验，采用手持糖度计测定浓度，液相色谱分析样品纯度，根据试验结果绘制绿豆抗性糊精的单柱洗脱曲线图。

1.2.4 绿豆抗性糊精的SSMB 纯化技术研究 试验采用SSMB-6Z6L 顺序式模拟移动色谱装置进行SSMB 纯化抗性糊精的分离试验，工艺流程见图1。系统共为6 根色谱柱，以串联方式连接，一个运行周期日每根色谱柱均要经过全进全出（S1）、大循环（S2）、小循环（S3）3 个步骤。当系统运行到某一根色谱柱时，第1 步：其上端进解吸剂D，下端放出AD（杂糖组分），间隔第3 根柱的柱上端进F（原料），在间隔的第4 根色谱柱柱下端放出BD（抗性糊精组分）；第2 步：物料在体系中不进不出，只进行大循环；第3 步：上端进解吸剂D，在间隔的第4 根色谱柱下端放出BD（抗性糊精组分）。然后切换到下一根色谱柱，依次重复3个步骤，然后循环下去直至试验结束[16]。

图1 SSMB 工艺流程图Fig.1 Process flow diagram of SSMB

1.2.5 电镜测定方法 采用扫描电镜分别对绿豆淀粉原料及纯化后的绿豆抗性糊精进行分析、观察处理前、后样品的形貌特征。

1.2.6 红外光谱测定方法 将绿豆淀粉原料及纯化后的绿豆抗性糊精分别与KBr 混合研磨，利用真空压片机进行压片，在4 000～400 cm-1范围进行红外光谱扫描。

1.2.7 X 射线衍射测定方法 将绿豆淀粉原料及纯化后的绿豆抗性糊精进行干燥、粉碎，采用X 射线衍射仪测定。

1.2.8 分子质量测定方法 参考肖健等[17]的方法，利用排阻色谱-十八角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统测定绿豆抗性糊精的分子质量及分布情况。采用牛血清白蛋白对仪器进行校正，流动相为0.15 mol/L NaNO3和0.02%NaN3，流速0.4 mL/min，结果采用ASTRA 6.1 软件进行数据分析。

1.2.9 单糖组成分析方法 参考Ciucanu 等[18]的方法并稍作改动 （样品处理全过程需要氮气保护），具体参考曹荣安等[19]的方法：首先进行还原和乙酰化处理，然后利用GC-MS 分析，色谱柱为HP-5MS 石英毛细管色谱柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），根据气谱出峰时间和质谱的离子峰对单糖进行定性分析，确定绿豆抗性糊精的单糖组成。

1.2.10 其它测定方法 糖浓度、纯度、收率、分离度的测定方法与文献[16]中的方法一致。

2 结果与分析

2.1 制备液分析结果

采用高效液相色谱对抗性糊精制备液原料液进行分析，分析结果见图2和表1。

2.2 制备色谱评价试验结果

制备色谱评价试验结果见表2，洗脱曲线图见图3。

从表2和图3可以看出，抗性糊精和杂糖的保留时间相差较大，通过计算分离度达到0.53，虽然还有一些重合部分没有完全分开，但可通过模拟移动色谱加长分离距离和时间，增加洗脱进水量，并通过试验优化达到很好的分离效果。

2.3 绿豆抗性糊精的SSMB 纯化工艺参数优化结果

根据制备色谱评价试验结果，确定SSMB 的进料折光60%，温度60 ℃，通过SSMB 法纯化抗性糊精的技术参数的优化结果见表3。

表1 抗性糊精原料分析结果Table 1 HPLC analysis of Phaseolus radiates L.resistant dextrin preparation liquid

图2 绿豆抗性糊精原料分析图谱Fig.2 HPLC chromatograms of Phaseolus radiates L.resistant dextrin

图3 洗脱曲线图Fig.3 The chart of elution curve

表2 制备色谱试验结果Table 2 The test results of preparation chromatographic

（续表2）

表3 SSMB 分离操作条件和试验结果Table 3 Operation conditions and test results on SSMB

由表3可知，综合考虑进样量、料水比、出口折光、纯度和收率等指标，第6 组试验的效果好于其它6 组，因此确定最佳分离条件为：进料量455 g/h，进水量682 g/h，循环量346 mL，此时出口折光为24.6%，纯度达到99.17%，收率达到91.31%。经SSMB 分离后抗性糊精组分的液相色谱图，见图4。

2.4 电镜测定结果与分析

绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的电镜测定结果，见图5。

从扫描电镜图可看出，在相同放大倍数下，绿豆淀粉与纯化后的绿豆抗性糊精具有完全不同的形态结构。绿豆淀粉颗粒较小，颗粒差异不大，为规则的椭圆形颗粒，颗粒表面光滑，这与相关报道结果一致[20-22]；而纯化后绿豆抗性糊精的颗粒较大且颗粒大小不一，为不规则碎片，颗粒表面粗糙，无定型结构。这是由于在酸和热的作用下，淀粉分子被打碎后，无规律的重新组合，聚合度大小不一，导致纯化后绿豆抗性糊精的颗粒大小不一，表面粗糙，更有利于水分子进入，因此，绿豆抗性糊精较绿豆淀粉的溶解性更好，黏度较小。

图4 抗性糊精组分液相色谱分析图谱Fig.4 HPLC chromatograms of Phaseolus radiates L.resistant dextrin component

表4 抗性糊精组分液相色谱分析结果Table 4 HPLC analysis of Phaseolus radiates L.resistant dextrin component

图5 绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的扫描电镜图Fig.5 SEM images of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

2.5 红外光谱测定结果与分析

绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的红外光谱测定结果，见图6。

图6 绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的红外光谱图Fig.6 FTIR spectrum of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

绿豆淀粉与绿豆抗性糊精在2 900，2 300，2 000，1 600 cm-1附近均有吸收峰，且两者红外光谱特征峰的峰形、位置没有明显变化，只是部分吸收峰的大小存在差异，这与相应化学键的含量有关，说明绿豆淀粉与绿豆抗性糊精的化学键或官能团没有发生明显变化。

2.6 X 射线衍射测定结果与分析

绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的X 射线衍射测定结果，见图7。

由图7可以看出，绿豆淀粉的结晶类型为C型结晶，2θ 分别为15.36°，17.32°，23.38°，经拟合分析其结晶度为34.37%，与现有研究一致[23-24]。绿豆抗性糊精的衍射峰很宽，直观看结晶度不高，其2θ 在20°左右，属于典型的非晶谱，因此绿豆抗性糊精属于非晶态。这是由于绿豆淀粉在酸热条件下降解，原有绿豆淀粉的结晶结构被破坏，而抗性糊精是以葡萄糖为主体的葡聚糖，为非晶态。

2.7 分子质量测定结果与分析

绿豆淀粉及绿豆抗性糊精分子质量测定结果，见图8。

图7 绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的X 射线衍射谱图Fig.7 XRD spectrum of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

图8 绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的示差折光检测曲线Fig.8 RI of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

由图8a和8b 可以看出，绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的示差折光检测曲线上均只有单一峰，说明两者的分子质量相对集中，利用ASTRA 6.1 软件分析可知，绿豆淀粉和绿豆抗性糊精的分子质量分别为（6 107.1±68.9）×103u 和（796.4±9.6）×103u，回转半径（Rg）为（280.4±10.4） nm 和（279.4±11.7）nm。绿豆抗性糊精的分子质量大约在800 ku 左右，而目前市面上常见的低聚果糖、菊粉等水溶性膳食纤维的分子质量只有几千到几万道尔顿，可见，绿豆抗性糊精的分子质量显著高于这些水溶性膳食纤维，因此，绿豆抗性糊精应具有一些独特的生物活性，需进一步研究。

2.8 抗性糊精单糖组成测定结果与分析

绿豆淀粉及绿豆抗性糊精单糖组成测定结果，见表5。

表5 绿豆淀粉及绿豆抗性糊精的单糖组成（%）Table 5 Monosaccharide compositions of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin（%）

由表5可以看出，绿豆淀粉的单糖组成相对于绿豆抗性糊精较为多样，共含有6 种单糖，而抗性糊精中的单糖组成只有3 种，以葡萄糖为主，还有少量的阿拉伯糖及木糖。这可能是由于绿豆淀粉在酸热条件下降解后，以葡萄糖为主体进行了重聚合，阿拉伯糖及木糖参与到了这一过程，共同形成了绿豆抗性糊精聚合体，而鼠李糖、甘露糖、半乳糖等未与葡萄糖发生聚合，在模拟移动床色谱分离过程中被当做杂糖分离出去，因此，在绿豆抗性糊精的单糖组成中没有检出。

3 结论

通过制备色谱评价、顺序式模拟移动色谱（SSMB）纯化抗性糊精的技术研究，确定最佳技术参数为：进料量455 g/h，进水量682 g/h，循环量346 mL，出口折光24.6%，纯度达到99.17%，收率达到91.31%。通过对纯化后绿豆抗性糊精的分子特性的分析发现，绿豆抗性糊精的颗粒较大且大小不一，为不规则碎片，颗粒表面变得粗糙，为无定型结构；经酸热处理后绿豆抗性糊精的化学键或官能团没有发生明显变化；经X 射线衍射测定发现绿豆抗性糊精为非晶态；绿豆抗性糊精的分子质量大约在800 ku 左右；其单糖组成主要以葡萄糖为主，还有少量的阿拉伯糖及木糖。本研究可以有效地纯化抗性糊精，为抗性糊精的工业化生产提供了一种高效的纯化技术，此外，可以为我国抗性糊精的研究提供理论依据。