Box-Behnken优化培养条件提高乳酸菌产脂肪酶活性

景智波 田建军* 赵丽华 张开屏 靳 烨

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018 2 内蒙古商贸职业学院食品系 呼和浩特010070）

脂肪酶是一类可以在油相、水相中将三脂酰甘油酯水解释放脂肪酸和甘油的生物酶类，又称甘油酯水解酶，被广泛应用于奶制品、肉制品等食品的精细加工中[1-3]。动物、植物和微生物都可产脂肪酶，其中微生物种类繁多，易于培养，可通过育种手段提高产酶量，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、pH 和底物特异性[4-6]，因此，工业上普遍采用培养微生物生产脂肪酶，特别是在食品加工行业。大量研究表明，多数微生物都可产脂肪酶以消化脂质，包括细菌28 个属，放线菌4 个属，酵母菌10 个属，其它真菌23 个属，共计65 个属的微生物产脂肪酶[7-9]。2007年Bora 等[10]分析不同碳源对所分离的植物乳杆菌LBN4 产脂肪酶能力影响时发现，橄榄油是诱导脂肪酶产生的重要碳源；2012年国外研究者Joseph 等[11]从冰川土壤样品中分离到嗜冷性细菌脂肪酶产生菌——微黄杆菌的最适产酶条件为15 ℃，pH 8.0，且Mn2+，Cu2+会抑制菌体产酶；2014年郭威[12]采用单因素及正交试验优化产脂肪酶的枯草芽孢杆菌3EA1-1 的产酶条件，结果发现pH 8.0，培养12 h，10%的接种量且经紫外诱变，其酶活力可提高到50.5 U/mL。张婵等[13]从富油样品中得到320 株产脂肪酶的细菌、酵母菌和霉菌，进一步分离获得1 株高产脂肪酶菌株，通过培养基优化，其最终酶活力达到9.28 U/mL，较优化前提高2.65 倍。

基于我国对微生物产脂肪酶的研究较晚，且主要集中于菌种的分离筛选，在实际工业化应用中高产脂肪酶的微生物菌种十分有限，因此筛选具有活力高、产量高、成本低的脂肪酶，开发脂肪酶应用新菌种十分必要。本试验中对实验室保藏的乳酸菌菌株富集培养，初筛和复筛得到1 株产酶较高的目的菌株，通过单因素及Box-Behnken试验优化产酶条件，得到酶活性较高的菌株。以此将该菌株作为进一步育种的出发菌株，为深入研究该菌所产脂肪酶的性质及应用提供理论依据，为发酵食品行业提供优良的菌株来源。

1 材料与方法

1.1 菌种

乳酸菌菌株，由内蒙古农业大学肉品科学与技术团队实验室提供，共计55 株，分离自西藏风干肉、巴盟中旗牛肉、羊肉样品中。

1.2 培养基

1）TPY 培养基（液体）：胰蛋白胨8 g，植物蛋白胨8 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，K2HPO42 g，KH2PO43 g，MgCl2-6H2O 0.5 g，半胱氨酸-HCL 0.5 g，吐温-80 1 mL，FeSO4-7H2O 10 mg，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5～6.8，121 ℃，灭菌20 min。

2）中性红油脂平板：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液120 mL，MgSO40.5 g，琼脂15 g，1.6%中性红溶液1 mL，pH 7.0～7.5，蒸馏水1 000 mL。

3）三丁酸甘油酯平板：A 液：Tris-HCl（pH 8.0 的缓冲液）；B 液：三丁酸甘油酯乳化液；A∶B=1∶9（体积比），琼脂1.5%。

4）富集培养基：酵母膏2 g，橄榄油5 mL，K2HPO41 g，MgSO4-7H2O 0.1 g，硫酸铵1 g，NaCl 0.5 g，pH 7.0，121 ℃，20 min。

5）发酵产酶培养基：硫酸铵1 g，硫酸镁1 g，磷酸二氢钾1 g，葡萄糖5 g，橄榄油乳化液12 mL，蛋白胨30 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃，20 min。

1.3 主要试剂与仪器

1.3.1 试剂 TPY 液体培养基成分、异丙醇、橄榄油，国药试剂有限公司；聚乙烯醇，源叶生物试剂公司；三丁酸甘油酯，罗恩试剂公司；对硝基苯酚（P-NP），北京百灵威科技有限公司；Triton X-100、阿拉伯树胶粉，索拉比试剂公司；DNA 试剂盒、蛋白酶K，天根试剂公司；Taq-DNA 聚合酶、dNTP MIX、DNA Marker、溶菌酶，北京全式金生物技术有限公司。

1.3.2 仪器与设备 ZSB-1200IIA2 超净工作台，南京依贝仪器设备公司；HM-12 型pH 计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ZSB-9272 电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；HH-4 恒温水浴锅，上海福码实验设备有限公司；Eppendorf 高速冷冻离心机，艾本德中国有限公司；SYNERGY H1酶标仪，雷康恒泰北京商贸有限公司；UV-180 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 产脂肪酶菌株的筛选 中性红平板变色法、三丁酸甘油酯透明圈法[13-15]：将供试菌株于TPY 液体培养基活化后接种于富集培养基中，37℃富集48 h，得到富集培养液。分别吸取各菌株富集液1 mL 涂布于中性红油脂平板中，37 ℃培养24～48 h，挑取平板变色菌落接种于发酵培养基中，37 ℃培养48 h，取2 mL 发酵培养液，其中1 mL 经10 000 r/min 离心10 min，获取上清液，即酶液。在配制好的三丁酸甘油酯的平板中打0.8 cm的小孔，分别移取100 μL 离心上清液及未离心菌液于小孔内，37 ℃培养3～5 d 后，测定透明圈直径，直径越大其产酶能力越强。

1.4.2 脂肪酶活力的测定 采用对硝基苯酚（PNPP 法）[16-18]。

酶活单位定义：在35 ℃反应条件下每分钟脂肪酶分解底物4-棕榈酸硝基苯酯（P-NPP）释放出1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位U。

A 液：10 mol/L 的4-棕榈酸硝基苯酯；B 液：50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲溶液；C 液：A 液与B 液以体积比1∶9 均匀混合，加入1%Triton X-100，0.1%阿拉伯树胶粉，现用现配。

酶活测定：0.9 mL 的C 液 （37 ℃恒温保温5 min）+0.1 mL 稀释酶液，37 ℃反 应10 min，1 mL 95%乙醇终止反应，测定OD410nm，以90 ℃水浴灭活酶液为对照。

对硝基苯酚浓度-吸光度标准曲线的绘制：称取0.08346 g 对硝基苯酚（p-NP）用少量95%乙醇溶解，然后用水定容到100 mL，标准溶液浓度为6 mmol/L，各取 0，2.5，5，7.5，10，15，20，30，40，50 μL p-NP 标准溶液于各试管内，加入底物缓冲液为（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），使得体系总体积为2 mL，并与95%乙醇按体积比2∶1 混匀，测定OD410nm处的吸光度值，绘制对硝基苯酚溶液浓度-吸光度值标准曲线。

式中，Y——对硝基苯酚浓度（μmol/L）；X——吸光度值（410 nm）。

1.4.3 菌种鉴定 采用天根生化科技公司生产的细菌基因组提取试剂盒，提取酶活性较高目的菌株TR1-1-3 的DNA 作模板，再利用16S rDNA 保守序列的通用引物27F 和1492R 作为引物进行PCR 扩增[19]，将扩增产物送到上海美吉生物科技有限公司测序鉴定，测序结果在NCBI 网站上进行BLAST 同源性比对，并利用MEGA 6.06 构建系统发育树。

1.4.4 单因素发酵产酶条件试验 发酵培养基成分固定，选取菌株接种量，温度、初始pH、培养时间、金属离子等因素分析对菌株发酵产酶的影响。

1.4.4.1 接种量对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响参照雷健美等[20]的方法略作修改：将菌株TR1-1-3 于TPY 液体培养基活化培养3 代后转接于富集培养基中，富集培养后按0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%的接种量接种于发酵产酶培养基中，测定不同组别下的酶活力，定义酶活最高值处的酶活力为100%，计算其余各处的相对酶活，以确定最适接种量。

1.4.4.2 培养温度、pH 值对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响 将菌株TR1-1-3 的培养温度分别控制在18，25，30，37，45 ℃下，并在最适温度下调整发酵产酶基础培养基中的pH 值为5，6，7，8，9，分别发酵48 h 后按照1.4.2 节的方法测定不同培养温度、pH 值下发酵上清液中的酶活力[21-22]，定义酶活最高值下的酶活力为100%，计算其余温度，各pH 值下的相对酶活，以确定最佳培养温度及pH值。

1.4.4.3 培养时间对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响 将产脂肪酶菌株TR1-1-3 接种于发酵产酶基础培养基中，分别培养0，12，24，36，48，60，72 h，取各时间段下的发酵上清液按照1.4.2 节的方法进行酶活测定[14]，定义酶活最高值处的酶活力为100%，计算其余各处的相对酶活，并测定各时间段下的菌株的生长特性及产酸情况，以确定最佳培养时间。

1.4.4.4 不同金属离子对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响 在发酵产酶基础培养基中分别添加0.4 g/L 的Fe2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Mn2+，将目的菌株接种于上述培养基中，37 ℃培养48 h 后，测定发酵上清液中的酶活[23]，与未添加的任何金属离子的体系做对照，且将未添加任何金属离子的酶活定义为100%，计算其余金属离子的相对酶活，分析金属离子对菌体产酶的影响。

1.4.5 Box-Behnken 优化菌株发酵产酶条件 选取接种量、温度、pH 值3 个因素作为自变量，根据Box-Behnken 设计建立3 因素3 水平试验，以脂肪酶酶活力为响应值，确定最佳产酶条件。试验因素与水平设计如表1所示。

表1 Box-Behnken 分析因素与水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken analysis

1.5 数据处理

试验数据取3 次平均值，图表采用Origin 9.0绘制，响应面试验设计与分析采用Design-Expert 8.0.6 软件。

2 结果与分析

2.1 高效产酶菌株筛选

利用中性红平板、三丁酸甘油酯透明圈、对硝基苯酚法测定实验室保藏菌株（55 株）脂肪酶活性，共筛选得到11 株产脂肪酶阳性菌株，具体的分离结果及酶活力见表2。

表2 产脂肪酶菌株的分离结果Table 2 Isolation results of lipase-producing strains

（续表2）

中性红平板呈红色说明菌株产生的脂肪酶可降解橄榄油类（C18）的长链底物，且在三丁酸甘油酯的平板中产生较大的透明圈，亦可说明菌株又能降解三丁酸甘油酯类（C4）的中短链底物。由表2的分离结果可知，所有菌株均可分解橄榄油类的长链底物及三丁酸甘油酯类的中短链底物，且离心后的透明圈直径明显大于未离心的透明圈直径，可见脂肪酶存在于菌株发酵培养上清液中，且TR1-1-17，TR1-1-18 等菌株的HC 值较高，分别为9.38，8.88，而酶活力只有2.27，2.84 U/mL，RB4-1-5 的酶活力最高为10.17 U/mL，HC 值却只有4.29，而TR1-1-3 菌株的HC 值（6.00）相对较大且酶活力（9.89 U/mL）较高，综合上述结果，将TR1-1-3 菌株作为后续研究的目的菌株。

2.2 目的菌株分子生物学鉴定

经上海美吉生物科技有限公司测序得到完整16S rDNA 序列与NCBI 数据库进行同源性比对，对该序列采用MEGA 6.06 软件N-J 算法构建系统发育树，结果见图1。

图1 菌株TR1-1-3 基于16S rDNA 系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strain TR1-1-3 based on 16S rDNA gene sequences

由图1可知，TR1-1-3 菌株与瑞士乳杆菌属同属于一个分支，亲缘关系最近，可归属于瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），且与瑞士乳杆菌ATCC 15009 同源性为99%。2015年何捷等[24]利用铜皂法从酸马奶中筛选出产脂肪酶的植物乳杆菌RC4，同年张晶晶等[25]采用油脂平板法筛选出1株脂肪酶柠檬酸杆菌，而对于瑞士乳杆菌产脂肪酶这一菌属鲜有报道。

2.3 单因素发酵产酶条件试验

2.3.1 接种量对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响分别按照不同接种量接种于发酵产酶基础培养基中，其酶活测定结果见图2。

由图2可知，当接种量不同时，菌株TR1-1-3相对酶活力不同，且各组之间几乎均存在显著差异（P<0.05），将作为后续响应面优化因素之一。接种量为1.5%～2.5%时，试验菌株的相对酶活均高于其它试验组，且2%的接种量为最佳接种量。菌株的接种量会影响菌株在培养基中的生长能力，接种量增大会提高菌株的生长速度，而接种量过大会使培养基中容量减少，使培养基中的代谢废物增加，进而影响菌株的发酵产酶能力。

2.3.2 培养温度、pH 值对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响 不同温度、pH 值的酶活测定结果见图3。

图2 接种量对菌株产酶的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the enzyme activity of the strain

图3 温度、pH 值对菌株产酶的影响Fig.3 Effect of temperature，pH value on the enzyme activity of the strain

由图3a可知，不同温度下菌株TR1-1-3 的相对酶活存在显著差异（P<0.05），可见培养温度对菌株发酵产酶影响较大，将此因素作为后续响应面优化因素之一。37 ℃时菌株相对酶活力最高为13.76 U/mL，且显著高于其它试验组，当温度为30，45 ℃时，相对酶活分别为81.15%，68.48%，与37 ℃时的相对酶活相差近20%～30%。由图3b可知，随着初始培养基中pH 值的升高，脂肪酶相对酶活力逐渐上升。在pH 值为6 时，相对酶活最高，产酶能力最强；当pH ＞6 时，相对酶活显著下降；在pH 值为8 和9 时，相对酶活仅为48%左右。因此，pH 6 是菌株发酵产酶的最适pH，即中性环境更利于菌株TR1-1-3 发酵产酶。此外，不同pH 值对菌株TR1-1-3 产酶的影响不同，且不同组别间存在显著差异（P<0.05），可将其作为后续响应面优化因素之一。因此，菌株发酵产酶的最适培养温度为37 ℃，最适pH 值为6。

2.3.3 培养时间对菌株TR1-1-3 发酵产酶的影响 不同培养时间的酶活测定结果见图4。由图4a，4b 可知，培养0～24 h 时，pH 值从6.05 下降到3.38，此时菌株产酶能力不断增强；培养24～48 h 时，培养基pH 值趋于平稳且菌株生长由对数期进入稳定期，而此时菌株产酶能力显著增强（P<0.05），进入急速增长时期；培养48 h 时，相对酶活力达到峰值；48 h 之后菌株产酶能力显著下降（P<0.05），分析可能是菌株已进入衰亡期，生长能力减弱，产酶能力下降，培养基已到达极限pH（3.11），较高的酸度同样抑制菌株的产酶能力。总体而言，在12 h 与72 h，24 h 与60 h 这些试验组之间没有显著差异（P<0.05），因此不作为后续响应面优化因素。

图4 发酵时间对菌株产酶的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the enzyme activity of the strain

2.3.4 不同金属离子对菌株发酵产酶的影响 在培养基中分别添加不同的金属离子，酶活测定结果见图5。

由图5可知，添加了Fe2+，Mn2+的相对酶活力均高于未添加的空白对照组，而添加Ca2+，Mg2+，Cu2+的菌株产酶能力低于对照组，可见Fe2+，Mn2+对菌株产脂肪酶活力有一定的激活作用，分析可能由于Fe2+，Mn2+是其脂肪酶的辅酶因子，可以促进产酶，而Ca2+，Mg2+，Cu2+对其有不同程度的抑制作用，可能由于金属离子占据了脂肪酶活性中心，改变了脂肪酶构象所致。其中Fe2+，Mg2+的效果与赵兴秀等[23]、刘晶等[26]的研究结果相反，这可能菌属差异所致。由于不同菌属的菌株对金属离子的吸附性不同，因此后续金属离子将不作为响应面优化的因素。

2.4 Box-Behnken 试验结果

2.4.1 Box-Behnken 试验设计及结果 在单因素试验结果的基础上，选取对酶活性影响显著的温度、pH 值、接种量3 个因素，3 个水平，根据Box-Behnken 设计17 组试验，试验设计与结果见表3。

2.4.2 模型方程的建立与显著性检验 利用Design-Expert 8.0.6 软件对表3试验数据进行二次多元回归拟合，得到酶活力（Y）与温度（A）、pH 值（B）和接种量（C）3 个因素的二次多元回归模型为：

图5 金属离子对菌株产酶的影响Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of the strain

Y=-21.57+0.44A+8.31B+0.17C+0.07AB+0.45AC+2.15BC-0.02A2-1.16B2-11.99C2

方程的决定系数R2=0.9812，说明该回归方程的拟合度很好，可通过此方程对试验结果进行分析，响应面试验方差分析结果见表4。

由表4可知，该模型P<0.01（极显著），失拟项P > 0.05（不显著），同时模型决定系数R2=0.9812，校正决定系数R2adj=0.957。以上分析表明模型拟合度很好，建立的模型可解释98%的响应值的变化，且试验误差较小，模型预测值与实测值之间具有高度相关性[27]，可利用此模型对酶活进行分析预测。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface central composite design and experimental results

表4 Box-Behnken 试验方差分析结果Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4的显著性检验结果可知，因素一次项C 对酶活影响极显著，A，B 对酶活影响不显著；交互项AB，AC，BC 对酶活影响显著，二次项A2，B2，C2对酶活影响显著；这说明试验因素与响应值之间不是简单的线性关系。各因素对酶活的影响程度依次为：C>B>A，即接种量>pH 值>温度。

2.4.3 响应面试验交互作用分析 响应面是各因素对响应值影响所构成的三维空间曲面图，它可以直观的反映出各个因素与响应值的交互作用，提供一种形象的观测响应值和试验参数水平关系的方法[28]。等高线的形状反映两因素之间交互作用的显著程度，等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著，而等高线呈椭圆形则表示两因素交互作用显著[29]。结果见图6。

图6 各因素交互作用对酶活力影响的响应面立体分析图Fig.6 Response surface stereo analysis of the interaction of various factors on enzyme activity

由图6可知，酶活随温度、pH 值和接种量的升高而增大，达到各因素中心值后，酶活随各因素升高而逐渐减小。对比各图，各因素对响应面的陡峭程度影响，由大到小依次为：C（接种量）>B（pH值）>A（温度）。从图6a可知，温度与pH 值间的立体投影-等高线为椭圆形，因素的交互作用影响显著；温度与接种量的图6b亦为椭圆形，因素的交互作用显著；pH 值与接种量图6c为椭圆形，交互作用显著，这与方差分析结果一致。结果表明相应面优化设计较好的反应了温度、pH 值、接种量对菌株产酶能力的影响。

根据Box-Behnken 试验所得结果及二次多项回归方程，获得了目的菌株TR1-1-3 的最佳发酵产酶条件：温度36.2 ℃，pH 5.84，接种量2%，此时的酶活力最高，产酶能力最强。

2.4.4 验证试验结果 结合实际情况，温度设定为36 ℃，pH 5.84，接种量2%的条件下做3 次重复验证试验，得到的试验结果平均值为10.92±0.54，与理论值（11.07）较为接近，拟合度较好，说明采用响应面得到的发酵条件参数真实可信，具有很好的指导意义。

3 结论

采用中性红平板变色法、三丁酸甘油酯透明圈法及对硝基苯酚法筛选得到1 株酶活力较高目的菌株TR1-1-3，经16S rDNA 分子生物学鉴定为瑞士乳杆菌。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken 响应面法优化发酵产酶条件。经二次多元回归模型方程计算可知，最适培养条件为：接种量2%，36 ℃，pH 5.84，发酵培养48 h 时，目标菌株TR1-1-3 的酶活性最强为10.92 U/mL，较优化前有所提高，验证试验结果与模型预测分析值基本相符；此外，金属离子Fe2+，Mn2+会激活菌体产酶，而Ca2+，Mg2+，Cu2+对其有不同程度的抑制作用。

通过Box-Behnken 响应面分析可知，各因素对菌株发酵产酶的影响大小依次为接种量>初始pH 值>培养温度，且接种量与pH 值，接种量与温度，pH 值与温度之间的交互作用对菌株发酵产酶影响显著。本试验所选目的菌株与工业用产脂肪酶菌株比较，该菌株的酶活力相对较低，有待通过相关诱变方法，基因克隆与表达等操作，进一步提高产酶量，为该菌株的开发、应用奠定基础。