miR-429-5p 调控Bcl2 的表达参与脊髓损伤过程中神经元细胞凋亡的机制

陶裕川，易 勇，周世军，王 翰

（宜宾市第二人民医院神经外科，四川宜宾 644000）

脑和脊髓损伤（spinal cord injury，SCI） 是交通事故中最常见的损伤之一，其病理改变主要包括神经元和胶质细胞的坏死和凋亡[1]。近年来，脊髓损伤后微小RNA （microRNA） 的异常表达已成为潜在的研究热点，然而，对其背后的机制仍知之甚少[2]。笔者研究了miR-429-5p 在脊髓损伤后的表达变化及其对脊柱神经元细胞的凋亡的影响，并探讨miR-429-5p 在脊髓损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只Sprague-Dawley 成年健康（SD） 大鼠，雌雄不限，体重200～220 g。

1.2 大鼠背根神经节细胞的培养

大鼠背根神经节细胞购于美国Sciencell 公司。F12 完全培养基（购于Gibco） 重悬，细胞悬液过200 目细胞筛，接种细胞至六孔板内，每孔接种105个细胞，37℃、5%二氧化碳培养箱内培养。培养24 h 后细胞开始贴壁，折光性良好，细胞呈锥形并长出小突起；3 d 时细胞形态完全长开，胞体增大，长出明显的轴突和树突，换液并加入3 μg/mL 的阿糖胞苷（购于Sigma） 继续培养；随后每2 d 换液一次，直至细胞融合度80%～90%时培养完成。受损组细胞待培养至对数生长期后将培养液换为加入含有150 μmol/L H2O2的无血清培养液培养24 h。miR-429-5p Inhibitor 组细胞在受损模型建立后依据说明书进行质粒的转染。提取蛋白并测定蛋白浓度，通过BCA 法蛋白定量后通过Western blot 法测Bcl2 蛋白表达水平。

1.3 荧光定量PCR 检测

实验通过荧光定量PCR 检测miR-429-5p 及其候选靶基因Bcl2 转录水平的差异。mRNA 水平检测采用GAPDH 作为内参基因，miRNAs 水平检测采用U6 作为内参基因。荧光定量PCR 扩增引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 扩增引物列表Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR

1.4 细胞凋亡检测

凋亡检测试剂盒购于东仁化学。根据试剂盒说明书操作后使用流式细胞分选仪下检测细胞凋亡情况。同时，通过Western Blot 法测Caspase3 的蛋白表达水平。

1.5 模型建立

随机将动物分为三组：正常（Control） 组，模型（Model） 组，miR-429-5p Inhibitor （model+miR-429-5p Inhibitor） 组。正常组（10 只）：SD 大鼠不做处理。模型组（20 只）：SD 大鼠以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g） 腹腔注射麻醉成功后，以T10锥体棘突为，以T10椎体棘突为中心，咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜，应用自制打击器打击，大鼠出现一过性的后肢痉挛和尾巴摆动即造模成功，依次缝合。miR-429-5p Inhibitor 组（20 只）：SD 大鼠建模后第1，3，5 天通过尾部静脉注射80 mg/kg 的miR-429-5 pInhibitor。建模7 d后处死老鼠。

1.6 标本的获取与切片

动物处死后，截取损伤（T10脊髓） 节段下约1 cm 的脊髓，4%多聚甲醛溶液固定，蔗糖梯度脱水，冰冻切片。

1.7 BBB 评分

模型建立后第1、3、7 天，通过Basso，Beattieand Bresnahan （BBB） 对脊柱损伤后模型的运动能力进行评分[3]。在分数评估期间，以大鼠的大鼠的后肢运动，稳定性，协调性，踩踏，躯干位置，脚趾间隙，脚掌位置和尾巴位置等为评分标准，采用双人在均不知道实验分组的前提下进行双盲独立观察，评分结果取均值。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.8 HE 染色与嗜银染色

切片脱水，包埋后待用，一部分用于HE 染色，经二甲苯脱蜡后使用苏木精染色5 min，分别浸入酸水及氨水中分色5 min，流水冲洗1 h，待冲掉染色剂后置于蒸馏水片刻，依次浸入70%，90%酒精中各10 min，予以酒精伊红染色液染色2 min。另一部分用于嗜银染色，具体操作参考实验试剂盒说明书。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 miR-429-5p 的表达

qPCR 的结果显示，当背根神经节细胞受损，miR-429-5p 的表达显著上升，而受损细胞受到miR-429-5p Inhibitor 的刺激后，miR-429-5p 的表达明显下降（P＜0.05），见图1。

图1 miR-429-5P 在背根神经节细胞受损时表达显著上升Fig.1 The expression of miR-429-5p significantlyincreased when dorsal root ganglion cells was damaged*P ＜0.05。

2.2 miR-429-5p 对背根神经节细胞的凋亡的影响

为进一步研究miR-429-5p 对背根神经节细胞的凋亡的影响，采用流式细胞仪验证HepG2 细胞凋亡，以此探讨miR-429-5p 是否可以诱导脊髓神经细胞的凋亡。对照组中背根神经节细胞凋亡比率为（4.483±0.087） %，相较于正常背根神经节细胞，当背根神经节细胞受损时，细胞凋亡率明显上升，为（32.00±1.585） %，而当受损细胞受到miR-429-5p Inhibitor 的刺激后，细胞凋亡率有明显下降，为（16.667±0.653） %，（P＜0.05 见图2。同时，通过Western blot 检测了细胞凋亡相关因子Caspase3 的表达，与对照相比，背根神经节细胞损伤后Caspase3 的表达明显上升，而miR-429-5p 的表达下调后Caspase3 的表达明显下降（P＜0.05），见图3。

2.3 BCL2 是miR-429-5p 的靶向因子

为探究miR-429-5p 对脊髓损伤的作用机制，本文通过TargetScan 数据库预测发现miR-429-5p的靶基因可能为 Bcl2，双荧光素酶检测miR-429-5p 及BCL2 的作用关系。双荧光素酶实验的结果显示，当细胞转染了克隆有Bcl2 3’-UTR 质粒后，miR-429-5p 过表达组荧光素酶活性明显受到抑制（P＜0.05），与对照组相比较差异明显。而转染克隆有Bcl2 3’-UTR 突变型质粒后，miR-429-5p 组荧光素酶的活性值之间无明显差异。因此证明了Bcl2 与miR-429-5p 之间的靶标关系，见表2、图4。

同时，Bcl2 的蛋白表达水平也通过Western blot 进行检测。结果显示，与空白对照组相比，Bcl2 的表达在背根神经节细胞损伤后明显升高。在miR-429-5p Inhibitor 的刺激下，Caspase3 的表达明显回升，再次验证了Bcl2 是miR-429-5p 的靶蛋白（图5）。

图2 miR-429-5p 参与调控脊髓神经细胞的凋亡Fig.2 miR-429-5p regulated the cell apoptosis of spinal neurons*P ＜0.05。

图3 miR-429-5p 调控Caspase3 的表达Fig.3 miR-429-5p regulated the expression of caspase 3*P ＜0.05。

表2 TargetScan 数据库查询预测miR-429-5p 的靶基因为Bcl2Tab.2 Bcl2 was predicted as the target gene of miR-429-5p via TargetScan database

图4 相对荧光活性证明Bcl2 是miR-429-5p 的靶基因Fig.4 Relative luciferase activity showed Bcl2 was the target of miR-429-5p*P ＜0.05。

图5 Bcl2 的蛋白表达受miR-429-5p 的调控Fig.5 miR-429-5p regulated the expression of Bcl2*P ＜0.05。

2.4 脊髓损伤后大鼠BBB 评分

术后1 d，除正常组外，SCI 模型组及miR-429-5p Inhibitor 组大鼠后肢运动均基本丧失，后肢处于完全麻痹状态，对疼痛刺激反应迟钝甚至无反应。术后7 d，SCI+miR-429-5pinhibitor 模型组大鼠的后肢运动能力恢复程度明显高于SCI 模型组，见图6。

2.5 miR-429 -5p 及BCL2 在脊髓损伤后大鼠中的表达

取损伤处脊髓样本，通过qPCR 检测大鼠脊髓损伤后miR-429-5p 及Bcl2 的表达变化。结果显示，相比正常组，脊髓损伤7d后，miR-429-5p的表达显著上升，而Bcl2的表达明显下降。当miR-429-5p的表达下调时，Bcl2的表达有明显回升，见图7。

图6 BBB 评分Fig.6 BBBscore*P ＜0.05。

图7 miR-425-5p 以及Bcl2 在脊髓损伤模型中的表达Fig.7 Expressions of miR-425-5p and Bcl2 in spinal cord injury model*P ＜0.05。

2.6 Caspase3 在脊髓损伤后大鼠中的表达

脊髓损伤后，凋亡相关因子Caspase3 的表达有明显上升，而miR-429-5p 的表达下调使Caspase3 的表达有明显减弱。再次证明miR-429-5p参与调控脊髓细胞损伤后的细胞凋亡，见图8。

2.7 嗜银染色和HE 染色

脊髓损伤7 d 后，模型组大鼠脊髓损伤区可见少量的再生神经纤维，且迂回杂乱。而miR-429-5p Inhibitor 组可见大量明显神经纤维（见图9A～C）。同时，HE 染色结果显示，模型组损伤部位局部结构紊乱，细胞走向无序，可见局部空洞，而miR-429-5p Inhibitor 的刺激使空洞明显减少（见图9D～E）。

图8 caspase3 在脊髓损伤后大鼠中的表达Fig.8 Expression ofcaspase3 in spinal cord injury model*P ＜0.05。

图9 嗜银染色和HE 染色（×200）Fig.9 Nerve silver staining and hematoxylin-eosin (HE) staining （×200）

3 讨论

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI） 可分类为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤不可逆，而对于继发性损伤，科学家们发现适当条件下脊髓有神经细胞再生，意味着SCI 有恢复的可能[4-6]。然而，不同于外周神经损伤，由于大量起源于大脑的皮层运动神经纤维和起源于背根神经节神经元的感觉神经纤维存在于脊髓中，脊髓损伤后功能的恢复依赖于感觉纤维和运动纤维的再生，因此，中枢神经系统损伤后的再生十分困难[7]。笔者通过检测miR-429-5p 在脊髓损伤中表达的变化，以及miR-429-5p 对脊髓神经细胞凋亡以及神经纤维再生的影响，发现miR-429-5p 通过靶向BCL2抑制脊髓损伤后神经细胞再生的过程。

大量研究表明，miRNAs（MicroRNAs） 作为参与调控个体发育，细胞凋亡、增殖、分化和疾病的发生等生命活动的内源性新型非编码小RNA，在许多疾病中发挥重要作用。在不同的疾病组织中，miRNAs 基因表达水平明显不同，因此miRNAs 通过调控其靶基因的表达而使疾病症状产生差异[8-10]。miR-429-5p 在人体肿瘤的发生和发展、炎症和纤维化、生殖以及细胞增殖、凋亡的调控中起重要作用[11]。然而，对于，对于miR-429-5p 在脊髓损伤中的表达与其作用机制却仍然知之甚少。笔者的研究结果发现，当脊髓神经细胞受到损伤，miR-429-5p 的表达明显上升。作为验证，损伤处脊髓的qPCR 的结果也表明脊髓损伤7 d 后，miR-429-5p 的表达显著上升。Li 等[12]发现，lncRNA Mirt2 通过下调miR-429 的表达减轻脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 导致的脊髓损伤。这与我们的实验结果一致。同时，miR-429-5p inhibitor的刺激使神经细胞受损后的凋亡程度明显降低，且通过BBB 评分发现脊髓损伤大鼠双后肢功能得到较高程度的恢复，神经纤维数量增多，表明了miR-429-5p 参与调控受损神经细胞的凋亡，下调miR-429-5p 的表达可减少神经细胞的凋亡。

脊髓损伤后，多种凋亡信息传入，大量的凋亡相关基因被激活，Bcl2（B-celllymphoma/leukemia 2） 是其中主要的抗凋亡因子。大量研究表明，Bcl-2 在脊髓损伤后有明显下降[13-15]，这与笔者的研究结果一致。有关Bcl2 抗凋亡的作用机制，有以下几种：（1） 抑制钙离子的释放[16]；（2） Bcl2通过阻止促凋亡基因信号传递或阻止诱导基因产物发挥作用；（3） Bcl2 通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用[17]。结果表明，Bcl2 是miR-429-5p 的靶基因，且当miR-429-5p 的表达受到抑制，Bcl2 在脊髓损伤模型中的表达明显上升，可推测miR-429-5p 通过调控Bcl-2 的表达来调控脊髓细胞的凋亡，从而参与脊髓损伤的再生过程。