辛伐他汀对人前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡及Ras／Rho通路的影响

陈亚梅，李冬水 ，余明主

（1.中国人民解放军第908医院，江西 南昌330002；2.南昌大学第一附属医院，江西 南昌330006）

近年来，去势抵抗性前列腺癌（CRPC）瘤内从头合成雄激素已成为研究热点，采用阿比特龙治疗CRPC患者可减弱肿瘤内新生雄激素的作用[1]。胆固醇是雄激素从头合成中的主要原料，且多种酶在此过程中起着重要作用。他汀类药物是一种治疗高脂血症的药物，通过抑制3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶来降低血清胆固醇水平[2]。其中，辛伐他汀可降低雄激素依赖性前列腺癌细胞的细胞内胆固醇水平[3]。在体外，他汀类药物可通过降低胆固醇含量来抑制直结肠癌细胞增殖[4]；可通过抑制胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）的表达来抑制前列腺癌的进展[5]。Ras／Rhodopsin（Rho）信号通路在细胞和前列腺癌细胞的生物学特性中起着不可替代的作用[6]。Ras在前列腺癌细胞株PC3中下调，抑制肿瘤的发展[7]。7Rho信号通路是Ras同源基因家族成员之一，Rho相关卷曲螺旋形成激酶可调节细胞肌动蛋白细胞骨架的形成，进而参与副黏病毒感染，与多种恶性肿瘤相关[8]。本研究中探讨了辛伐他汀对人前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响，以及Ras／Rho信号通路在此过程中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo Revco公司）；高速低温离心机（美国Sigma公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；Thermo Scientific液相色谱质谱联用仪（LC－MS，美国Thermo Scientific公 司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪（美国Thermo公司）；实时荧光定量PCR（美国Bio－Rad公司）。

试药：辛伐他汀、多西紫杉醇、5－乙基－2′－脱氧尿嘧啶核苷（EDU，美国Sigma公司，批号分别为S6196，S1572，S3482）；前列腺癌PC3细胞（上海生命科学研究院细胞库，批号为CM－125429）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号为160044）；RPMI－1640培养基（美国Hyclone公司，批号为190045）；细胞增殖成像分析试剂盒（EDU，美国Invitrogen公司，批号为1574）；TdT介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术公司，批号为CA1020）；TRIzol（天根生化科技有限公司，批号为DP421）；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒（大连TaKaRa公司，批号为RR047A）；UltraSYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号为TK08045）；MicroRNA let－7（let－7）、神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物（NRAS）、Ras、Rho和U6引物（大连TaKaRa公司）。let－7上游引物为5′－CGGCTCGCATGAGGTAGTAGG－3′，下游引物为5′－CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA－3′；NRAS上游引物为5′－GCGAAGGCTTCCTCTGTGTA－3′，下游引物为5′－CCCGTAACTCTTGGCCAGTT－3′；Ras上游引物为5′－GGGAGGATTGTGGCCTTCTT－3′，下游引物为5′－TGTGCAGGTGCCGGTTCAG－3′；Rho上游引物为5′－ATCATGGGCTGGACATTGGA－3′，下游引物为5′－ACAGGGACATCAGTCGCTTCA－3′；U6引物序列：上游引物为5′－GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT－3′，下游引物为5′－CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT－3′。

1.2 细胞培养及分组

用含胎牛血清（10%）的RPMI－1640培养液在37℃及5%CO2、饱和湿度的条件下培养PC3细胞，隔天换液，当细胞融合率达90%时，进行细胞传代。分为阴性对照组（A组），阳性对照组（B组），辛伐他汀低、中、高剂量组（C1组、C2组、C3组）。A组加入无血清RPMI－1640培养基，B组加入含有终浓度为4μmol／L的多西紫杉醇[9]，C1组、C2组、C3组分别加入终浓度为1.25，2.50，5.00μmol／L的辛伐他汀[10]，继续培养48 h后进行相关检测。

1.3 EDU法测定PC3细胞增殖

将PC3细胞以5×103个／孔接种于96孔板中，每孔200μL，待细胞融合后，按1.2项下给予受试物干预48 h，换用50 mmol／L EDU溶液孵育4 h，4%甲醛固定15 min，0.5% Triton X－100处理20 min，以便在室温下通透。将细胞在室温下用100 mL Apollo染色30 min，再用100 mL Hoechst避光孵育30 min。荧光显微镜下进行观察和摄像，并计算EDU掺入率[EDU掺入率＝EDU阳性细胞数（红色染色的细胞）／C4－2细胞数（蓝色染色的细胞）]。

1.4 TUNEL法测定PC3细胞凋亡

将PC3细胞以5×104个／孔接种于6孔板内，每孔3 mL，待细胞融合后，按1.2项下方法给予受试物干预48 h，弃培养基，4%甲醛固定15 min，依次用50%，75%，95%，100%乙醇脱水5 min，磷酸盐缓冲液冲洗2次，0.5%Triton X－100处理20 min，加入TUNEL工作液，37℃孵育1 h，使用荧光显微镜检测凋亡细胞（绿色荧光染色），碘化丙啶（PI）反染细胞核，计数绿色和红色荧光细胞[计数阳性细胞率（%）＝绿色荧光细胞数／蓝色荧光细胞数]。

1.5 液相色谱－串联质谱(LC－MS／MS)法测定培养基中睾酮和二氢睾酮（DHT）的浓度

将PC3细胞以5×104个／孔接种于6孔板内，每孔3 mL，待细胞融合后，按1.2项下方法给予受试物干预48 h，将雄烯二酮（100μmol／L）添加到培养基中，24 h后收集培养基，并使用LC－MS／MS测量睾酮和DHT浓度。

1.6 实时荧光定量PCR（RT－PCR）检测let－7，NRAS，Ras和Rho m RNA水平

以5×104个／孔接种于6孔板内，每孔3 mL，待细胞融合后，按1.2项下方法给予受试物干预48 h，使用TRIzol从培养的细胞中提取总RNA，用蛋白核酸检测仪测定mRNA浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明合成将提取的总RNA逆转录为cDNA，制备20μL反应体系，进行扩增。反应条件为预变性94℃30 s，变性95℃5 s，60℃45 s，38个循环。61℃时采集荧光，用实时荧光定量PCR仪检测，对其表达量进行分析，以U6作为内参，采用2－△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 23.0统计学软件分析。数据采用均数±标准差（X±s）表示，用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK－q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对PC3细胞增殖和凋亡的影响

与A组相比，B组、C1组、C2组、C3组EDU的掺入率降低，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，C1组、C2组、C3组的EDU掺入率增加，细胞凋亡率降低，随着辛伐他汀剂量的增加，EDU掺入率逐渐降低，细胞凋亡率逐渐增加，差异有统计学意义（P＜0.05)。详见表1和图1。

表1 辛伐他汀对PC3细胞增殖和凋亡、PC3细胞中睾酮和DHT及let－7，NRAS，Ras和Rho mRNA表达的影响（X±s）

图1 辛伐他汀对PC3细胞增殖和凋亡的影响

2.2 对PC3细胞中睾酮和DHT的影响

与A组相比，B组和C1组、C2组、C3组睾酮和DHT降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，C2组和C3组睾酮和DHT增加，随着辛伐他汀剂量的增加，睾酮和DHT逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.3 对PC3细胞中let－7，NRAS，Ras和Rho m RNA表达的影响

与A组相比，B组和C1组、C2组、C3组let－7增加，NRAS，Ras，Rho降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，C2组和C3组let－7降低，NRAS，Ras，Rho增加，随着辛伐他汀剂量的增加，let－7逐渐增加，NRAS，Ras，Rho增加降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

3 讨论

他汀类药物可用于预防癌症或潜在的癌症，且与总前列腺癌风险间呈负相关[11]，与总体风险无关，但与晚期前列腺癌风险降低有关（尤其是转移性或致命性前列腺癌风险）[12]。他汀类药物在体外具有多种抑制前列腺癌进展的生物学活性，如降低胆固醇含量、抑制细胞周期蛋白依赖性激酶－2（CDK－2）活性、降低胰岛素样生长因子1(IGF1)表达、增加移植瘤细胞中膜联蛋白A10（ANXA10）表达，诱导前列腺癌细胞凋亡或阻止前列腺癌细胞的增殖，但其抗癌机制尚不清楚[13]。本研究中使用已知为侵袭性前列腺癌细胞的PC3细胞系，发现辛伐他汀可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，表明辛伐他汀有可能减缓高级别前列腺癌的发展，但疗效不如多西紫杉醇。但考虑到多西紫杉醇的耐药性和毒副作用，辛伐他汀依然是一种很有前景的替代药物。

他汀类药物可降低雄激素依赖性前列腺癌细胞的细胞内胆固醇水平，而雄激素依赖性前列腺癌细胞不能调节低密度脂蛋白受体的表达[14]。从头合成雄激素是CRPC的治疗目标。在雄激素合成途径中，胆固醇是主要物质[15]。本研究结果显示，辛伐他汀可降低睾酮和DHT水平。

Ras／Rho信号通路可介导抑制高转移性前列腺癌细胞；参与前列腺癌血管生成的过程，被阻断的Ras／Rho信号通路可抑制肿瘤细胞的生长和血管生成[16]。前列腺癌细胞中Ras／Rho信号通路的表达受雄激素调节。DHT和人工合成的雄激素（R1881）在雄激素受体阴性的PC3细胞中激活了Ras／Rho信号通路[17]。同时，R1881不会影响雄激素受体阳性的前列腺癌LNCaP细胞中Ras／Rho信号通路的表达[18]。本研究结果显示，辛伐他汀可抑制PC3细胞中Ras和Rho表达。let－7在不同物种中均有表达，人类let－7表达的变化与多种癌症相关。上调的let－7在体内外均可抑制前列腺癌的克隆扩增、肿瘤再生和细胞增殖[19]。let－7可能通过调节与自我更新和生长能力相关的癌基因的表达来抑制前列腺癌的形成[20]。Targetscan网站显示，let－7和NRAS间存在特殊的结合区域。多数前列腺癌细胞携带突变的NRAS，NRAS突变可能成为前列腺癌监测和治疗的潜在生物标志物[21]。let－7通过靶向与NRAS相似的基因，在不同的癌症中发挥抑制作用。当NRAS过表达时，会诱导癌细胞的持续增殖[22]。推测上调的let－7和下调的NRAS可能抑制CRPC的发展；与Ras／Rho信号通路相关的基因NRAS被let－7抑制，从而阻断Ras／Rho信号通路，抑制其增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，辛伐他汀能抑制PC3细胞增殖，促进PC3细胞凋亡，其作用机制可能与Ras／Rho信号通路激活有关。辛伐他汀可能是治疗前列腺癌的有效策略，但其具体作用机制和临床应用仍需作进一步研究。