芪芎通络胶囊对小鼠骨质疏松的改善作用及机制研究

王鹏程，唐 渊

（1.广东省珠海市口腔医院，广东 珠海519000；2.中国人民解放军陆军军医大学药学院，重庆400038）

骨质疏松症（OP）是一种以骨体积减少、骨小梁退化、骨力学性能下降和骨折易感性为特征的全身性疾病[1]。目前，临床治疗OP的药物有雌激素类药物、钙剂维生素D、磷酸盐、氟化物等，均有副作用，限制了临床的使用[2－4]。中医认为，OP是由肝血虚和肾气虚导致的并发症[5－6]，故补肾补血是中医治疗OP的主要方法。芪芎通络胶囊有益气活血、化痰通络功效，主要用于治疗气虚血瘀痰阻证，症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木、眩晕等，同时具有改善OP的作用。骨保护素（OPG）存在于骨组织中，其表达水平降低，可减少骨组织形成，引起严重的OP。核因子κB受体激活剂配体（RANKL）促进破骨细胞前体细胞增殖、分化成破骨细胞，并增强其骨吸收活性；阻断RANK基因表达，则可抑制破骨细胞活性，改善OP的形成[7]。口服维甲酸可促进破骨细胞形成，使得骨吸收大于骨形成，形成维甲酸性OP，其是动物实验中常用的OP模型[8－9]。本研究中采用维甲酸灌胃方式制备小鼠OP模型，研究芪芎通络胶囊对维甲酸导致小鼠OP的改善作用及作用机制，为临床治疗OP提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：TI－U型正置显微镜(尼康映象仪器销售＜中国＞有限公司)；Micro CT（上海徕卡仪器有限公司）；680型酶标仪（伯乐生命医学产品＜上海＞有限公司）；S7220－B型组织切片机（沈阳恒松科技有限公司）；5810R型离心机（艾本德中国有限公司）；CP225D型电子天平(德国赛多利斯集团，精度为0.01 mg)。

试药：维甲酸（上海生工生物有限公司，批号为A506728）；仙灵骨葆胶囊（国药集团同济堂制药有限公司，批号为A14001226041）；芪芎通络胶囊（吉林万通药业股份有限公司，批号为14000219623）；血清钙检测试剂盒（批号为C004－3－1），血清磷检测试剂盒（批号为C006－1－1），均购自南京建成生物工程研究所；OPG抗体（北京博奥森生物技术公司，批号为bs－20624R）；RANKL抗体（Cell Singaling Technology，批号为3959）。

动物：清洁级雌性昆明小鼠，9周龄，购自中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心（动物使用合格证号为1103221911003384）。饲养条件为温度（24±1）℃，相对湿度45%～65%，光照12 h黑暗12 h，适应性饲养3 d后开展实验，期间小鼠自由进食和饮水。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药

将48只小鼠随机分为对照组（A组）、模型组（B组）、仙灵骨葆组（C组）和芪芎通络胶囊高、中、低剂量组（D1组，D2组，D3组），每组8只。由于中药粉末和维甲酸不易溶于水，采用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC－Na)配置成混悬液。除A组外，各组小鼠于每天9：00给予105 mg／kg维甲酸灌胃，14 d后用Quantum FX型小动物CT测定小鼠骨密度，确定造模是否成功。A组每天9：00继续给予上述剂量维甲酸，C组18：00灌胃给予仙灵骨葆胶囊1.5 g／kg，D1组，D2组，D3组分别给予芪芎通络胶囊高、中、低剂量（按生药量计为1.8，0.9，0.45 g／kg）治疗，A组和B组小鼠给予等体积的0.5% CMC－Na，持续14 d。实验开始时和结束时，称定动物的体质量。

1.2.2 股骨计量学指标

取左侧股骨，去除附着的软组织，测定股骨计量学指标。股骨湿重和干重：用电子天平称量股骨湿重和干重（mg）；股骨长度：用游标卡尺测量股骨长度（mm）；股骨直径：分别于股骨的近端1／3点、中点、远端1／3点，用游标卡尺量取最大外径及最小外径，取6个值的平均值，得股骨直径（mm）。

1.2.3 血清钙、磷分析和脏器指数

实验结束时摘眼球取血，以1 000 g离心15 min，分离血清，按试剂盒说明书操作，检测血清钙、血清磷的含量。取血完成后处死小鼠，取肝、脾、胸腺，并称定质量，计算脏器指数。脏器指数（mg／g）＝脏器质量（mg）／体质量（g）。

1.2.4 骨密度分析

取小鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，运用Micro CT扫描股骨，采用Materialise软件计算骨密度。

1.2.5 免疫组化分析

取左侧股骨，用4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，进行免疫组化实验，以DAB显色呈棕黄色为阳性，采用image J软件进行灰度值分析。

1.3 统计学处理

采用GraphPadPrism 7软件分析。数据以X±s表示，两组间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量和脏器指数

实验末期，与A组相比，B组动物体质量、胸腺指数和肝脏指数均显著降低（P＜0.05）。与B组相比，C组、D1组、D2组、D3组的实验末期体质量和肝脏指数均呈升高趋势，且C组和D1组胸腺指数显著升高（P＜0.05），C组和D1组的脾脏指数呈下降趋势。详见表1。

2.2 股骨指标

与A组相比，B组小鼠股骨湿重和股骨干重均显著降低（P＜0.05），股骨长度和股骨直径呈降低趋势。与B组比较，C组、D1组、D2组、D3组股骨湿重和干重显著增加（P＜0.05），股骨长度和股骨直径有增加趋势。详见表2。

2.3 血清钙、磷分析

与A组相比，B组小鼠血清钙含量显著降低（P＜0.05），血清磷含量显著升高（P＜0.05）。与B组相比，C组血清钙含量显著升高（P＜0.05），血清磷含量显著下降（P＜0.05）；D1组血清钙含量显著升高（P＜0.05），D1组、D2组、D3组血清磷含量显著降低（P＜0.05)。详见表3。

表1 各组小鼠体质量和脏器指数比较（X±s，n＝8）

表2 各组小鼠股骨指标比较（X±s，n＝8）

表3 各组小鼠血清钙、血清磷含量比较（X±s，n＝8）

2.4 骨密度

与A组相比，B组小鼠的骨密度显著降低（P＜0.05）；与B组相比，C组和D1组骨密度显著升高（P＜0.05）。D2组和D3组骨密度呈升高趋势。详见图1。

图1 小鼠骨密度检测

2.5 对骨组织中OPG／RANKL蛋白表达比值的影响

图2 骨组织中OPG／RANKL蛋白表达比值

图3 骨组织中OPG和RANKL蛋白表达情况

OPG／RANKL蛋白的表达比值改变是影响骨质疏松症的重要作用机制之一。OPG主要表达在破骨细胞的细胞膜、细胞质或细胞核上，RANKL主要表达在细胞膜表面，免疫组化检测以DAB显色呈棕黄色。与A组相比，B组小鼠股骨中OPG／RANKL蛋白的表达比值显著下降（P＜0.05）；与B组相比，C组、D1组、D2组，D3组股骨中OPG／RANKL蛋白的表达比值显著升高（P＜0.05）。详见图2和图3。

3 讨论

OP常发生在老年人群体中，其主要特征为骨骼强度降低，导致骨折复发率增加[9]。研究发现，地黄、淫羊藿、黄芪、丹参、知母、补骨脂、吴茱萸等中药不仅单味使用具有抗绝经期OP的作用，配伍使用也有一定疗效[10－11]。维甲酸可损伤性腺功能，减少雌激素分泌，使破骨细胞数量增加，骨吸收增加，骨量丢失，造成骨密度下降，可用于制备典型的动物OP模型[12]。本研究结果显示，维甲酸造模后小鼠的体质量、骨密度及血清钙含量均显著下降，血清磷含量升高，OPG／RANKL蛋白表达比值明显下降。D1组、D2组、D3组，尤其D1组对模型小鼠OP相关指标具有明显改善作用，可发挥抗OP作用。

OPG和RANKL信号通路是破骨细胞的重要调控通路，其表达比例是影响骨吸收的重要因素。骨组织中OPG的过度表达可增加破骨细胞的生成量，减少骨组织形成，引起OP[13]。RANKL与破骨细胞前体细胞表面RANK上的TRAF6特异性结合后，激活NF结合转录因子、c－Jun氨基末端激酶，活化T细胞核因子、蛋白激酶B等，促进破骨细胞前体细胞增殖、分化成破骨细胞，增强其骨吸收活性[14]。OPG下调和RANKL上调，将促进破骨细胞骨吸收活性，导致OP[15]。本研究结果显示，芪芎通络胶囊能上调股骨组织中OPG蛋白表达，下调RANKL蛋白表达，可抑制破骨细胞的活性，导致骨吸收减少，减缓骨密度的降低，减少钙质流失，发挥抗OP作用。

芪芎通络胶囊是中药复方制剂，由黄芪、三七、川芎、莶草、胆南星5味中药组方，具有益气活血、化痰通络功效，主要用于轻中度动脉粥样硬化性血栓性脑梗死气虚血瘀痰阻证。方中，黄芪补气血、健脾胃，常用来治疗骨痛和腰膝酸软，可改善钙的吸收，其所含黄芪甲苷可上调OP模型鼠血清中OPG蛋白的表达、降低RANKL蛋白的表达；三七中有效成分三七总皂苷临床广泛用于骨折的愈合、软组织的损伤及骨关节的损伤等，可促进成骨细胞增殖、上调骨组织中OPG蛋白的表达；川芎可有效治疗甲状腺功能亢进性OP，与丹参合用，能升高OP模型鼠血清钙含量，增加股骨骨密度[16]。

莶草、胆南星入肝经，具有补血作用； 莶草入肾经，具有强筋骨作用。

本研究结果表明，芪芎通络胶囊可能通过上调OPG／RANKL蛋白比值，调节血清钙、血清、磷含量，改善骨密度状况，发挥抗OP作用，但仍有待在不同种属动物、不同OP模型中作进一步研究。