脑膜癌病患者的脑脊液细胞学与免疫组化诊断价值分析

高标 ，李相磊 ，马春燕 ，黄利娜 ，刘妍 ，高园林

（开封市中心医院1.检验科；2.神经内科，河南 开封 475001）

脑膜癌病（Meningeal carcinomatosis，MC）又称脑膜转移癌或癌性脑膜炎，在实体肿瘤患者中患病率约为4%～15%，为中枢神经系统转移瘤特殊分布类型之一，是肿瘤细胞通过血行转移或脑脊液散播浸润脑膜和脊髓膜，随血管周围间隙侵入大脑皮质而发生一种恶性病变，临床表现为脑、脊髓受损和脑神经症状， 是恶性肿瘤致死的重要原因之一[1，2]。MC 起病隐匿，转移形式较为特殊，临床表现复杂多样，且一般颅内无实质性病变，影像学检查缺乏特异性，临床诊断较为困难，易发生漏诊和误诊，影响患者预后。本研究选取55 例MC 患者，以所有患者脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）为检测基础，分析CSF 细胞学在MC 中应用价值，并采用免疫细胞化学方法检测上皮膜抗原（EMA）、细胞角蛋白20（CK20）、癌胚抗原（CEA）、新天冬氨酸蛋白酶 A（Napsin A）、甲状腺转录因子（TTF-1）、细胞角蛋白7（CK7）6 种肿瘤标记物在 CSF 中定位表达，为寻找MC 原发灶提供依据，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取 2013 年 8 月-2018 年 11 月我院收治的55 例MC 患者，均根据症状体征、影像学检查、CSF 细胞学检查证实，并签署知情同意书，排除预估生存期＜6 个月者、休克者、可疑颅内占位病变、脑疝、凝血功能障碍患者，其中男26 例，女29例，年龄 38～78 岁，平均 50.18±6.09 岁，发病至确诊时间 7～129d， 平均 55.79±27.90d。 本研究符合《世界医学会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器 罗氏COBAS C702 全自动生化分析仪购置于美国罗氏公司；FMU-6 细胞涂片离心沉淀仪购置于西安安美生物科技有限公司； 细胞图像分析系统及奥林巴斯CX31 型光学显微镜均购置于上海北昂医疗技术有限公司。

1.2.2 主要试剂 瑞吉氏染液购置于珠海索贝生物技术有限公司；鼠抗人EMA 单克隆抗体；鼠抗人CK20 单克隆抗体；鼠抗人CEA 单克隆抗体；鼠抗人Napsin A 单克隆抗体； 鼠抗人TTF-1 单克隆抗体（8G7G3/1）；鼠抗人CK7 单克隆抗体均购于北京中杉科技有限公司。

1.2.3 CSF 常规细胞学检查 腰椎穿刺第3 管进行细胞学检查，留取5mL 脑脊液，采用改良牛鲍氏计数盘进行白细胞计数，应用玻片离心沉淀法，收集CSF 细胞玻片 7 张。

1.2.4 CSF 生化检查 腰椎穿刺第2 管， 进行蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平检测。

1.2.5 CSF 细胞学、 免疫组化染色检查 标本均严格按SOP 文件操作。

1.2.6 结果判定 ⑴瑞吉氏染色阳性标准: 发现肿瘤细胞。 细胞形态学特点：细胞大小不一，细胞体大，胞核常偏向一侧，胞浆着色变深，富含空泡，多为蓝色，黑色素瘤细胞浆内显示黑色素颗粒沉着，部分患者可显示丝状分裂，核浆比例增大，核仁清晰，核染色质变粗，染色加深，核异型明显，双核或多核，肿瘤细胞较多患者细胞聚集为团簇状，见图1、2。⑵TTF-1 阳性标准：细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，当细胞质存在表达时，细胞核表达强度高于细胞质方可评定为阳性； ⑶EMA、CK20、CEA、Napsin A、CK7 阳性标准：未分化或低分化腺癌EMA 主要分布于细胞浆中， 高分化腺癌EMA 呈膜型分布，细胞膜、胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，弥漫性非颗粒状细胞质染色判为阴性，CK20、CEA、Napsin A、CK7 胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。

图1

图2

1.3 观察指标 ⑴瑞吉氏染色结果。 ⑵临床症状、脑脊液常规与生化检查、肿瘤原发病灶分布情况。⑶EMA、CEA、CK7 诊断 MC 灵敏度、 阳性预测值。⑷EMA、CK20、CEA、Napsin A、TTF-1、CK7 在原发灶中阳性表达率。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据，计量资料以（±s）表示、t 检验，计数资料用 n（%） 表示、χ2检验。 P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 瑞吉氏染色结果 55 例MC 患者瑞吉氏染色结果均为阳性，其中 27 例（49.09%，27/55）首次腰穿发现肿瘤细胞，28 例（50.91%，28/55）经反复腰穿发现。

2.2 临床症状、CSF 常规与生化检查、 肿瘤原发灶分布情况 MC 首发症状以头痛（83.64%）、恶心/呕吐（78.18%）、精神改变（78.18%）、脑膜刺激征（63.6 4%）、意识不清（47.27%）、听神经受累（32.73%）为主， WBC、蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平均伴有不同程度异常，肿瘤原发灶为肺癌（34.55%）、乳腺癌（25.45%）、胃癌（21.82%）、卵巢癌（18.18%），见表1。

表1 临床症状、CSF 常规与生化检查、肿瘤原发灶分布情况(n=55)

2.3 诊断 MC 情况 55 例 MC 患者中，EMA 阳性45 例，CEA 阳性 29 例，CK7 阳性 33 例，EMA+CEA阳性 47 例，EMA+CK7 阳性 50 例，EMA+CEA+CK7阳性 53 例 。 EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 检测阳性预测值均为100%，灵敏度比较差异显著（P＜0.05）；EMA+CEA+CK7 检测灵敏度高于任何单一或两两联合灵敏度 （P＜0.05）。 见表2。

表2 各指标诊断灵敏度与阳性预测值（n=55）

2.4 各指标在原发灶中阳性表达率 EMA 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中阳性表达率比较无显著差异（P＞0.05）；CK7 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中阳性表达率比较差异显著 （P＜0.05）；CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中阳性表达率均为0，低于胃癌中阳性表达率 25.00%（P＜0.05）；CEA 在乳腺癌中阳性表达率为0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中阳性表达率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）；Napsin A 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中阳性表达率均为0，低于肺癌中阳性表达率 84.21%（P＜0.05）；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中阳性表达率均为0，低于肺癌中阳性表达率 73.68%（P＜0.05）。 见表3。

3 讨论

MC 好发于中老年人群，病情进展较快，早期诊断对改善患者预后具有积极意义。 MC 临床症状表现出多样化，本研究中首发症状以头痛、恶心/呕吐、精神改变、脑膜刺激征、意识不清、听神经受累为主，其中头痛占83.64%，患者多为阵发性头痛，较为剧烈， 以转移性疼痛或全头部胀痛为表现形式，随着疾病进展，头痛时间逐渐延长，出现胃肠道反应，严重者可伴有喷射性呕吐，63.64%患者早期即出现脑膜刺激征，其原因与癌细胞转移至脑膜后导致局部炎性反应，诱发颅内压变化，影响脑脊液循环有关。 当癌细胞随血管间隙进入脑实质，可出现精神变化、意识障碍，当癌细胞侵犯脊神经和脑神经，可导致听神经受累、视力障碍等[3，4]。但以上特征表现在较多疾病中均可呈现，缺乏特异性，单一依赖临床症状无法对MC 进行诊断。

以往研究证实，MC 患者常表现为压力增高，白细胞计数轻度增高或正常，蛋白含量增加，葡萄糖与氯化物水平降低[5-7]。 本研究CSF 常规检查与生化检查中，72.73% MC 患者压力增高，WBC 水平均低于100×106/L，70.91%患者蛋白含量低于0.45 g/L，72.73%患者葡萄糖含量低于 2.5mmoL/L，52.73%患者氯化物水平低于118mmoL/L，与以往研究基本相符，但这些特征易与脑膜炎混淆，因此需进行CSF 细胞学检查明确诊断。 米芳等[8]研究指出，CSF 癌细胞第一次腰穿后阳性率为45%左右，第二次腰穿阳性率为80%左右，3 次腰穿后阳性率在90%以上。 本研究55 例患者瑞吉氏染色结果均为阳性，其中49.09%首次腰穿发现肿瘤细胞，其余患者经反复腰穿发现， 提示反复腰穿进行CSF 细胞学检查有助于提高诊断阳性率。此外MC 病理类型以腺癌、鳞癌为主，文献报道指出，MC 原发灶来源日本主要为胃癌，欧美主要为乳腺癌，国内以肺癌为首[9，10]。 本研究结果显示肿瘤原发病灶肺癌占34.55%，乳腺癌占25.45%、胃癌占21.82%、卵巢癌占18.18%，与以上报道相符。

目前CSF 细胞学检查被认为是诊断疾病金标准，但肿瘤细胞不一定出现在CSF 中，故首次腰穿阳性率较低。 既往资料显示，14.3% MC 患者需进行反复多次腰穿才可发现癌细胞[11]。分析其原因可能为：⑴疾病早期癌细胞脱落至CSF 数量较少；⑵MC 以软脑膜受累较为常见，腰穿留取标本相距软脑膜较远，一次腰穿不能反应疾病状态；⑶CSF 流畅不通，肿瘤细胞分布不均匀，具有一定随机性。因此对疑似MC 患者进行反复多次腰穿对疾病早期诊断是必要的。 常规细胞学检查以细胞形态学特点为诊断基础，具有简单直观特点，但癌细胞多附于脑膜脊膜或漂浮于脑脊液， 增生繁殖无束缚性，形态特征发生了变化，部分癌细胞异型性不明显，较难与退化细胞、反应性细胞区分，且MC 原发肿瘤类型较多，依靠单一CSF 细胞形态难以明确原发病灶[12]。

表3 各指标在原发灶中阳性表达率（n=55）

EMA 存在于各种类型正常上皮中， 在上皮分化肿瘤、某些恶性淋巴瘤中亦有表达；CEA 广泛存在于各种上皮样肿瘤；CK7 表达于上皮源性原发与转移肿瘤细胞、正常上皮中，因为其细胞转化过程中保持免疫学特性和亚微结构，故可用于鉴别癌细胞来源[13]； CK20 被认为是膀胱移行上皮肿瘤和胃肠道肿瘤较为特异的标志[14]；Napsin A 特异性表达于正常肾和肺中，肿瘤组织中，其多表达于肺癌[15]；TTF-1 主要表达于细支气管上皮细胞、 肺泡细胞、甲状腺细胞等[16]。 本研究尝试采用免疫细胞化学方法检测6 种肿瘤标记物在CSF 中定位表达，结果发现 EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 诊断MC 阳性预测值均为100%，EMA+CEA+CK7 诊断MC 灵敏度高于任何单一或两两联合灵敏度（P＜0.05），提示 EMA+CEA+CK7 联合检测可对MC 进行辅助性诊断。 而CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中阳性表达率均为0，低于胃癌中阳性表达率 25.00%（P＜0.05），说明 CK20 阳性提示MC 原发灶为胃癌可能性较大；CEA 在乳腺癌中阳性表达率为0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中阳性表达率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）， 说明 CEA阴性提示原发灶为乳腺癌可能性较小；Napsin A在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中阳性表达率均为0，低于肺癌中阳性表达率 84.21%（P＜0.05），说明 Napsin A阳性提示原发灶为肺癌可能性较大；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中阳性表达率均为0，低于肺癌中阳性表达率 73.68%（P＜0.05）， 说明 TTF-1 阳性提示原发灶为肺癌可能性较大。

综上所述，MC 临床表现缺乏特异性，对于CSF常规检查与生化检查异常中枢神经系统病变患者应开展CSF 细胞学检查，EMA+CEA+CK7 可用于MC 辅助性诊断，CK20、CEA、Napsin A、TTF-1 有助于MC 原发灶鉴别。 本研究不足之处是因CSF标本留取量较少，未对6 种肿瘤标记物进行各种组合免疫组化，取得成果仍需大样本量实验验证。