A 型口蹄疫抗体固相竞争ELISA 检测方法的建立

李敏杰，许智强，刘彦玲，周国辉，于 力

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊病创新团队，黑龙江哈尔滨150069）

口 蹄 疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是 由FMD 病毒（FMDV）引起的猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，给养殖业造成严重的危害和重大的经济损失，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A 类传染病之首。FMDV 主要分为7 个血清型：O 型、A 型、亚洲Ⅰ型、C 型、南非Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中以O 型和A 型FMDV 分布最广，危害最大[1]，其中A 型FMDV 在亚洲、非洲和南美洲均有流行。目前A 型流行趋势增强，准确检测FMDV 的血清型和隐性携带病毒动物，是防控该病的首要环节。使用FMD 灭活疫苗是发展中国家防控该病的主要手段，因此可以通过建立检测FM⁃DV 结构蛋白抗体的方法来评价FMD 疫苗的免疫效力、指导FMD 疫苗的免疫接种计划、血清流行病学调查和非免疫地区的疫情监测[2]。

FMD 的诊断技术包括补体结合试验、病毒中和试验和酶联免疫吸附反应（ELISA）等血清学方法。OIE 推荐的3 种检测FMDV 抗体的方法为：病毒中和试验（Virus neutralization test，VNT）、液相阻断ELI⁃SA（Liquid-phase blocking ELISA，LPBE）和固相竞争ELISA（Solid-phase competition ELISA，SPCE）。而VNT 作为最经典的血清学诊断方法，能够检测血清的中和抗体滴度，结果较准确可靠，是评价疫苗免疫效力的金标准，但该方法对实验室条件要求较高，需要操作活的病毒，只能在专业的实验室开展，且试验周期长[3-4]。LPBE 方法检测速度快，适合大批量血清样品的检测，重复性较好，但该方法存在一定的假阳性率，同时也受灭活抗原稳定性的影响[5]；SPCE 方法保留了LPBE 的优点，而且提高了方法的特异性和稳定性，重复性更好[6]。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体（MAb）能够识别单一抗原位点，特异性更强，稳定性更高，均质性更好，可批量生产且制备成本大大降低。本研究在多克隆抗体固相竞争ELISA 方法的基础上，选择本研究室制备的一株不同血清型FMDV 通用的MAb 和一株A 型FMDV 特异性的MAb，建立了一种基于MAb 的新型的SPCE 方法，用于检测A 型FMDV抗体，评价FMD 疫苗的免疫效力等。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MAb 3D9[7]（3.47 mg/mL），按文献[8]方法制备的HRP 标记的纯化MAb 9A9[9]（1.75 mg/mL，效价为1 5 000）均由本实验室制备并保存；A 型FMDV 抗原由中牧实业股份有限公司提供；仓鼠肾细胞(BHK-21)由本实验室保存；健康雌性BALB/c 小鼠购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；经VNT[10]检测为A 型FMDV 阴性的血清227 份，包括牛血清112 份、猪血清115 份，采自未注射疫苗未发生FMD 的动物；经VNT 检测为A 型FMDV 阳性的血清240 份，包括牛血清130 份、猪血清110份，为经FMD 灭活疫苗免疫动物的血清；待检血清470 份，包括羊血清90 份、牛血清170 份、猪血清210 份；TMB 底物、辣根过氧化物酶购自Sigma 公司；A 型FMD 抗体LPBE 检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；Jeno A 型FMDV ELISA 抗体检测试剂盒购自韩国金诺生物科技公司；酶标板购自Costar 公司；DEAE-Sephadex A-50 层析柱购自GE 公司；A 型、O 型FMD 抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒（BCV）、牛轮状病毒（BRV）以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪瘟病毒（CSFV）的标准阳性血清均由本实验室保存。

1.2 SPEC 反应条件的优化 采用MAb 3D9 作为捕获抗体包被ELISA 板，加入灭活的抗原孵育，HRP-9A9 作为检测抗体和待检血清同时加入，TMB 显色，浓硫酸终止显色，利用酶标仪测OD450nm值，建立SPCE 实验程序。采用方阵法，优化各反应条件：MAb 3D9 包被浓度（3.48 μg/mL、1.74 μg/mL、1.16 μg/mL、0.70 μg/mL、0.35 μg/mL）、抗原稀释度（1 4、1 5、1 6）、抗原孵育时间（37 ℃/1 h、37 ℃/2 h）、待检血清稀释度（1 8、1 16、1 32、1 64）、检测MAb 9A9 稀释度（1 1 000、1 2 000、1 3 000、1 4 000、1 5 000）、检测MAb 与待检血清孵育时间（37 ℃/1 h、37 ℃/2 h）、显色液显色时间（10 min、15 min、20 min），初步建立检测血清中A 型FMDV抗体的SPCE 方法。

1.3 阴性和阳性临界值的确定 利用优化后的反应条件检测经VNT 检测的阴性血清227 份和检测的A型FMDV 阳性血清血清240 份。以抑制百分率PI 作为结果判定依据，对检测样品定性评价。

PI 计算公式：

1.4 特异性试验 利用本研究建立的SPCE 方法分别检测A 型、O 型FMD 抗体阳性标准血清、BCV、BRV、PRRSV、PCV 和CSFV 标准阳性血清，评价该方法的特异性。

1.5 敏感性试验 将3 份经VNT 检测为阳性的血清样品，经2 倍倍比稀释（1 8～1 4 096）后，利用本实验建立的方法进行检测，同时利用LPBE 检测试剂盒和VNT[9]分别检测，对三者的敏感性进行比较，评估该方法的敏感性。

1.6 重复性试验 使用同一批次包被的ELISA 板，选取7 份待检血清（FMD 灭活疫苗免疫猪血清3 份，免疫牛血清3 份，免疫羊血清1 份）在3 个不同的时间点检测，试验重复3 次，评价该方法的批内重复性；使用3 个批次包被的ELISA 板，选取同样的7 份待检血清进行检测，试验重复3 次，评价该方法的批间重复性。

1.7 SPCE 与LPBE、VNT 检测结果的相关性比较 从470 份待检血清中随机选择112 份血清样品（猪血清47 份，牛血清45 份，羊血清20 份），分别利用本研究建立的SPCE、A 型FMD 抗体LPBE 检测试剂盒和VNT 检测其抗体水平，利用MedCalcv15.8软件制作相关性曲线比较并分析三者检测结果的相关性。

1.8 临床血清样品的检测 利用本研究建立的SPCE 方法和JenoA 型FMDV ELISA 抗体检测试剂盒分别对90 份羊血清、170 份牛血清、210 份猪血清进行检测，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率，并采用MedCalcv15.8 软件分析二者检测结果的差异性。

2 结 果

2.1 SPEC 反应条件的优化结果 经方阵滴定法确定该SPCE 方法的最优反应条件见表1。

表1 SPCE 反应条件的优化结果Table 1 Optimized results of reaction conditions of SPCE

2.2 SPCE 临界值的确定 利用建立的SPEC 检测阴阳性血清，确定临界值。PI 计算结果显示，最佳区分阴阳性血清的稀释度为1 32，在此稀释度所有阴性血清的PI 值均小于35%，而所有阳性血清的PI值均高于35%（图1）。因此，当血清1 32 稀释时，将SPCE 检测的PI 临界值确定为35%。

2.3 特异性试验结果 利用该A 型FMDV 抗体SPCE方法分别检测A 型、O 型FMDV、BCV、BRV、PRRS、PCV、CSFV 的标准阳性血清。结果显示，除A 型FMDV 标准阳性血清外，其余血清检测结果均为阴性，且未出现交叉反应（表2）。表明本研究建立的SPCE 方法特异性较强。

2.4 敏感性试验结果 取3 份经VNT 检测为阳性的血清样品2 倍倍比稀释后，经本研究建立的SPCE 方法检测，评估该方法的敏感性，结果显示，ELISA检测血清样品的OD450nm值随着阳性血清稀释倍数增加，其OD450nm值平缓递减，且与VNT 测定的效价呈正相关。当样品1 稀释至1 1 024 时，计算得到的PI值仍大于35%，而将其稀释到1 2 048 时，PI 值小于35%，判为阴性（图2），所以SPCE 方法检测该阳性血清的最低稀释度为1 1 024，LPBE 检测该阳性血清的敏感性为1 2 048，VNT 的敏感性为1 512；当样品2 稀释至1 256 时，计算得到的PI 值仍大于35%，而稀释到1 512 时，PI 值小于35%，判为阴性（图2），所以SPCE 方法检测该阳性血清的最低稀释度为1 256，LPBE 检测该样品的敏感性为1 512，VNT 的敏感性为1 128；当样品3 稀释至1 128 时，计算得到的PI 值仍大于35%，而稀释到1 256 时，PI 值小于35%，判为阴性（图2），所以SPCE 方法检测该阳性血清的最低稀释度为1 128，LPBE 检测该阳性血清的敏感性为1 256，VNT 的敏感性为1 64。以上结果表明，该方法的敏感性略低于LPBE，但高于VNT，敏感性较高。

图1 阴性血清和阳性血清的PI 值分布图Fig. 1 Frequency distribution of the percentage inhibitions recorded of negative and positive sera

表2 特异性试验结果Table 2 Specificity test results of SPCE

图2 敏感性试验结果Fig. 2 Sensitivity test result of SPCE

2.5 SPCE 的重复性试验结果 使用同一批次制备的ELISA 板，检测随机选取的7 份血清，经计算结果显示批内变异系数低于10%；使用不同批次制备的ELISA 板检测随机选取的7 份血清，经计算结果示批间变异系数低于10%（表3）。表明该方法重复性好。

2.6 SPCE 与LPBE、VNT 检测结果的相关性比较结果 利用SPCE、LPBE 和VNT 分别检测从470 份未经检测血清中随机选择的112 份血清样品（猪血清47 份，牛血清45 份，羊血清20 份），利用MedCal⁃cv15.8 软件分析三者的相关性。结果显示，SPCE 与LPBE的相关系数为0.901（图3A），与VNT的相关系数为0.916（图3B）（相关系数|r|≥0.8 时属于高度相关），均为高度相关。且该方法与VNT相关性更高，表明该方法检测结果准确性较高。

表3 重复性试验结果（n=7）Table 3 Reproducibility test results of SPCE (n=7)

图3 SPCE 与LPBE（A）、VNT（B）检测结果的相关性分析Fig. 3 Scatter plots and calculated regression lines between VNT and SPCE

2.7 临床血清样品的检测结果 利用本研究建立的SPCE 方法检测羊血清90 份，共检出A 型FMDV 抗体阳性样品54 份，阴性样品36 份；Jeno A 型FMDV ELISA 抗体检测试剂盒共检出阳性样品53 份，阴性样品37 份，二者的阳性符合率为92.5%，阴性符合率为86.5%，总体符合率为90.0%，p<0.05，差异显著具有统计学意义。该方法检测牛血清170 份，共检出A 型FMDV 抗体阳性样品90 份，阴性样品80份。Jeno 试剂盒共检出阳性样品86 份，阴性样品84份，二者总体符合率为91.8%，阳性符合率为93.8%，阴性符合率为89.0%。检测猪血清210份，共检出A型FMDV 抗体阳性样品116 份，阴性样品94 份。Jeno 抗体检测试剂盒共检出A 型FMDV 抗体阳性样品113份，阴性样品97份，其中总体符合率为89.0%，阳性符合率为91.4%，阴性符合率为86.2%（表4）。以上结果表明，该SPCE 方法与Jeno 试剂盒符合率较高，检测结果较为准确，可用于A 型FMDV 血清抗体的检测。不同动物血清抗体的检测结果表明，该方法对牛血清的检测结果与Jeno 试剂盒的总体符合率高于猪血清和羊血清。

表4 临床样品的检测结果Table 4 Detection results of clinical samples

3 讨 论

疫苗免疫接种是我国防控传染病的主要策略，但大部分针对传染病的诊断试剂盒均需要从国外购买，近年来国内也相继开发出一些疫病的检测试剂盒，但在敏感性、特异性、稳定性上与国外产品相比还存在一定的差距[5]。VNT 是评价其它FMDV 抗体检测方法的金标准，但其工作量大、耗时长，不适合高通量的检测。Hamblin C 等建立了LPBE 方法检测FMDV 抗体，该方法使用灭活的抗原，避免了病毒扩散的风险，特异性、敏感性得到了国际的一致认可，目前在世界上已被广泛使用，但是其稳定性受不同批次捕获多抗和检测多抗等试剂的影响而未广泛使用[11]。Mackay 等建立了SPCE 方法检测FM⁃DV 的抗体，其操作简便，耗时短，更适合大批量血清的检测[12]。

与多克隆抗体相比，MAb 能够识别单一抗原位点，敏感性高、特异性强。本研究中使用不同血清型FMDV 通用的MAb 作为包被抗体，能够与7 个血清型的FMDV 结合，亲和力强并且具有很强的抗原捕获能力[6]。本研究使用的检测MAb 9A9 识别的是A 型FMDV 一个保守的抗原表位，是A 型FMDV 广谱且具有强中和活性的MAb[7]。MAb 用作检测试剂具有批次之间稳定性好、易于标准化生产等优点，广泛应用于病毒检测与疫病诊断试剂盒的研制中。因此，本研究利用经HRP 标记的MAb 作为检测抗体，将其和待检血清同时加入ELISA 板中，只需要1 h 反应时间即可完成全部检测过程，与LPBE 和VNT 相比可以节省许多时间。且其检测结果与VNT有较高的相关性，能够更准确用于检测临床样品、评价疫苗的免疫效力。

本研究建立的SPCE 敏感性与LPBE 和VNT 接近，在与Jeno 试剂盒比较试验中，该方法对3 种动物血清的检测结果与Jeno 试剂盒的总体符合率均较高，表明该方法的敏感性较高，能够检测到较低水平的血清抗体滴度。该方法能够特异性的检测A 型FMDV 标准阳性血清而不能检出其他病毒的阳性血清，表明该方法特异性较强。重复试验结果表明该方法的重复性较好，这可能与该方法使用了MAb 提高了其稳定性有关。

利用本研究建立的SPCE 与LPBE 和VNT 同时检测112 份血清，SPCE 与LPBE、VNT 的相关系数分别是0.901、0.916，表明SPCE 与VNT 具有高度的相关性。对于部分疫苗免疫血清[4]，利用SPCE 和VNT只能检测出较低的抗体滴度，而利用LPBE 则可检测出较高的抗体滴度，这可能是由于疫苗免疫之后诱导机体产生了一部分无中和活性的抗体，这也从侧面表明LPBE 特异性较弱的原因。

本研究以MAb 3D9 作为包被抗体、9A9 作为检测抗体，建立了A 型FMDV 抗体的SPCE 检测方法，并进行了临床应用。该方法特异性、敏感性、重复性均较好，与VNT 和LPBE 符合率较高，且操作简单耗时少，为评价A 型FMD 疫苗的免疫效果提供了候选方法。