竹叶石膏汤改善2型糖尿病大鼠记忆功能衰退症状的作用机制

李玉洁 李雪莹 陈莹莹 李艺璇 安敬文 王聪慧 张肖雅 杨丽萍

(河南中医药大学 1基础医学院，河南 郑州 450046；2第一临床医学院)

2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布的《糖尿病地图》中显示，全球约有4.25亿糖尿病患者，推测到2045年，全球糖尿病患病人数将达到6.29亿，中国患病人数将达1.343亿〔1〕。糖尿病属于慢性疾病，是由于胰岛素分泌或作用缺陷所引起的代谢性疾病〔2〕，而绝大多数糖尿病患者罹患的是2型糖尿病(T2DM)〔3〕。流行病学研究报告指出，T2DM是发生认知功能障碍和痴呆的独立危险因素，且该病导致患者日后发生痴呆的概率约为正常人的1.6倍〔4〕。研究指出，糖尿病患者并发认知功能减退(CI)的发生率为10.8%～17.5%，轻度认知功能障碍(MCI)是阿尔茨海默病(AD)的早期阶段，每年有10%～15% 会演变为AD〔5〕。药物干预是治疗糖尿病及其并发症的有效途径，但目前已有的降糖药对于T2DM引起的记忆力下降尚没有较好的治疗作用，因此探索T2DM发生认知功能障碍的作用机制，寻找有效的治疗药物，对糖尿病及其并发症的预防和治疗有重大意义。传统中医认为，糖尿病属于中医学消渴范畴，基本病机为阴津亏耗，燥热偏盛〔6〕。本证治法若只取清热而不益气生津，则气液难复；若只益气生津而不清热，又虑邪热复炽，余热复燃。正如叶天士所说“炉烟已息，灰中有火”。竹叶石膏汤首见于《伤寒论》，由竹叶、石膏、麦冬、人参、半夏、粳米、炙甘草组成，此汤清热养阴，益气生津，为疗效优越的清补之剂，既在于清，又在于补，扶正祛邪，重在调和，被称为“以大寒之剂，易为清补之方”，主要用于治疗消渴症。现代药理学研究发现，方中人参的主成分人参皂苷Rg1具有较强的神经保护作用〔7〕；竹叶中竹叶黄酮可以提高大鼠海马神经元的存活率〔8〕；半夏中的鸟苷依赖G蛋白耦联受体(GPCR)介导的细胞内信号转导通路能发挥神经保护作用〔9〕等。但目前，关于竹叶石膏汤改善T2DM记忆力下降的相关研究几乎没有，因此本实验观察竹叶石膏汤对T2DM大鼠学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 链脲佐菌素(STZ)北京索莱宝生物科技有限公司产品，批号：18883-66-4；安稳型血糖试条，三诺生物传感股份有限公司产品，批号2804NR；猪油，浙江金恩食品有限公司产品，批号20180809；蛋黄粉，河南宏益生物科技有限公司产品，批号20180628；猪胆盐，北京奥博星生物技术有限责任公司产品，批号20180605；胆固醇，北京索莱宝生物科技有限公司产品，批号108D113，50%葡萄糖溶液，开封制药集团有限公司产品，批号：H41022336；大鼠β淀粉样蛋白(Aβ)1～42酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，东莞市谱标实验器材科技有限公司产品，产品货号：DRE20040；大鼠胰岛素ELISA试剂盒，东莞市谱标实验器材科技有限公司产品，货号：DRE20732；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒，东莞市谱标实验器材科技有限公司产品，产品货号：DRE20040，蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所产品，货号：A045-2。

1.2中药制备 竹叶石膏汤中药免煎剂均购自广东一方制药有限公司，用药量按千克体重折算系数法计算大鼠等效剂量，使用时将粳米熬汤，过滤，用米汤溶解药物。

1.3仪器 MultisKanFc酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；KDC-160HR低温高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；AB204-N万分之一精密分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。Morris水迷宫(成都太盟软件有限公司)

1.4动物 8周龄，SPF级雄性SD大鼠10只，体重(320±20)g，72周龄，SPF级雄性SD大鼠50只，体重(530±30)g，均购自山西医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(晋)20150001，实验室保持12 h光照，12 h避光循环饲养，按照组别分别给予标准饲料和高糖高脂饲料，自由饮水。实验室温度20～25℃，湿度50%～60%。

1.5分组及建模

1.5.1T2DM大鼠模型的诱导 取8周龄青年雄性大鼠10只，设为正常组，给予正常饲料喂养，另取72周龄老年雄性大鼠50只采用高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(STZ，45 mg/kg)诱导T2DM大鼠模型〔6〕，具体方法为，所有造模大鼠给予高糖高脂饲料喂养1 w后，禁食不禁水24 h，之后大鼠腹腔注射STZ 45 mg/kg，3 d后检测空腹血糖，空腹血糖值≥16.7 mmol/L，视为建模成功〔10〕。高脂饲料配方，参照AIN-93G啮齿类实验动物合成饲料配方〔11〕配制方法如下：猪油40 g，胆固醇40 g，胆盐20 g，蛋黄粉40 g，普通饲料600 g，蒸馏水适量。充分搅拌后晾干，制成长为0.8 cm的条状饲料。

1.5.2动物的分组给药 将造模成功的大鼠随机分为模型组,竹叶石膏汤低剂量(低剂量)组、竹叶石膏汤高剂量(高剂量)组，每组10只，低剂量及高剂量组每天灌胃竹叶石膏汤水煎液，模型组与正常组每天灌胃等体积生理盐水，连续给药14 d。

低剂量组用药量为临床人用药量的6.25倍；高剂量组用药量为临床人用药量的20倍；正常组及模型组每日灌胃生理盐水，给药体积均为4 ml。

1.6指标检测

1.6.1行为学指标检测 用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力〔12〕，①定位巡航实验：给药后10 d开始进行Morris水迷宫测试，连续训练3 d，每天从4个不同象限中点将大鼠放入水池(头朝池壁)，任其在水中游泳，让其自行寻找平台，爬上平台后让其在平台上停留10 s，以使其强化记忆效果，若在60 s内未能爬上平台，则由实验人员将大鼠引导至目标平台，同样让其在平台停留10 s(平台放置于第1象限，距圆点1/3处)。②空间探索实验：定位巡航实验结束后24 h，撤除平台，进行空间探索实验，将大鼠从原平台对侧象限中点放入，任其自由游泳90 s，用影像记录系统记录大鼠穿过原平台所在位置的次数、目标象限停留时间及中心活动时间。

1.6.2生化指标检测 于给药后第9天进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)，大鼠禁食12 h后，灌胃2 g/kg葡萄糖溶液，分别于灌胃前(0 min)、灌胃葡萄糖溶液后30 min、60 min及120 min检测大鼠血糖水平〔13〕。

于给药后第14天行为学实验结束后，大鼠摘眼球取血，分离血清，之后处死大鼠，迅速于冰面上分离海马体，并用冷的生理盐水制作1%海马体组织匀浆，-20℃冷冻保存备用。按试剂盒指示检测大鼠血糖、空腹胰岛素水平，并检测大鼠海马组织TNF-α及Aβ1～42含量。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1一般情况观察 与正常组相比，模型组大鼠的进食量、饮水量及尿量有升高趋势且饮水量、尿量差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，低、高剂量组进食量、饮水量及尿量呈下降趋势，且除低剂量组摄食量外差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 竹叶石膏汤对T2DM大鼠模型摄食量、饮水量及尿量的影响

2.2竹叶石膏汤对T2DM大鼠体重的影响 与造模前比较，造模后模型组及低、高剂量组大鼠体重均显著下降(P<0.01)。给药后，模型组体重持续下降，与造模后比较差异有统计学意义(P>0.05)；低、高剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但各组(除正常组)与自身造模后(即给药前)体重相比明显降低，但低剂量组大鼠体重降低比例最小。正常组各时间点体重差异无统计学意义(P>0.05)。 见表2。

表2 竹叶石膏汤对T2DM模型大鼠体重的影响

2.3竹叶石膏汤对T2DM大鼠模型OGTT的影响 给药3 d后，正常组大鼠空腹血糖在正常范围，口服定量葡萄糖后15 min升到峰值，30 min时恢复至正常水平；与正常组相比，模型组大鼠空腹血糖显著升高(P<0.01)，口服定量葡萄糖后30 min血糖升至峰值，60 min时仍未恢复至空腹血糖水平，120 min时血糖浓度恢复至空腹血糖水平，各时间点血糖均显著升高，与正常组比较均有显著差异(P<0.01)；与模型组相比，低剂量组大鼠空腹血糖显著性降低(P<0.05)，但仍显著高于正常组(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平达到峰值，30～120 min呈下降趋势，但120 min时，血糖仍未恢复至空腹血糖水平，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较无显著差异(P>0.05)；高剂量组大鼠空腹血糖基本恢复正常水平，与正常组比较无显著差异(P>0.05)，与模型组比较有显著差异(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平达到峰值，30～120 min呈下降趋势，120 min时血糖浓度基本恢复至空腹血糖水平，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，与正常组比较无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 竹叶石膏汤对T2DM大鼠模型口服葡萄糖不同时间糖耐量的影响

2.4竹叶石膏汤对T2DM大鼠空腹血糖及胰岛素水平的影响 与正常组比较，模型组空腹血糖水平显著升高(P<0.01)，空腹胰岛素水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，末次给药后，低、高剂量组大鼠空腹血糖水平均显著降低(P<0.01)，血清胰岛素水平有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 竹叶石膏汤对T2DM大鼠空腹血糖及血清胰岛素水平的影响

2.5竹叶石膏汤对T2DM大鼠海马TNF-α及Aβ1～42水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠海马TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量组大鼠海马组织TNF-α水平显著降低(P<0.05)。海马Aβ1～42水平检测结果显示，与正常组比较，模型组及各用药组海马Aβ1～42水平变化均不明显，各组间比较均无显著差异(P>0.05)。见表5。

表5 竹叶石膏汤对T2DM大鼠海马TNF-α及Aβ1～42水平的影响

2.6竹叶石膏汤对T2DM大鼠学习记忆能力的影响 Morris水迷宫实验检测结果显示，给药14 d后，目标象限停留时间检测结果显示，与正常组比较，模型组及各用药组，在原站台所在象限(即目标象限)停留时间变化均不明显，各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较，模型组中心活动时间显著降低(P<0.05)；与模型组比较，低剂量组大鼠中心活动时间显著升高(P<0.01)，但高剂量组大鼠中心活动时间变化不明显，与模型组比较无显著差异(P>0.05)。与正常组比较，模型组大鼠穿越平台次数显著降低(P<0.01)；与模型组比较，低剂量组大鼠穿越平台次数显著升高(P<0.01)，同样，高剂量组大鼠穿越平台次数变化也不明显，与模型组比较无显著差异(P>0.05)，见表6。

表6 竹叶石膏汤对T2DM大鼠学习记忆能力的影响

3 讨 论

建立理想的糖尿病模型是糖尿病发病机制和临床新药研发的基础，目前T2DM模型主要分为：自发型糖尿病模型动物、转基因模型动物和诱发性糖尿病模型动物。其中自发型糖尿病模型与转基因糖尿病模型动物因价格昂贵，饲养要求高，在国内较少应用〔14〕。诱发性糖尿病模型动物在国内应用较为广泛，通常采用各种物理或化学的方法损伤部分胰脏或胰岛 β 细胞导致胰岛素分泌不足，同时结合高糖高脂饲料喂养，造成外周组织对胰岛素不敏感，引起高血糖症状，病理生理改变符合人类T2DM〔15〕。 药物诱导的糖尿病模型具有发病率高、造模时间较短，且价格低廉的优点。本实验选用72周龄，雄性老年大鼠，高糖高脂饲料喂养1 w后，腹腔注射小剂量STZ，成功建立了T2DM大鼠模型，造模时间较短，价格低廉，病理生理改变符合人类T2DM发病过程，为T2DM动物模型的建立提供了新思路。

T2DM认知功能障碍的发病机制至今仍未能被完全阐明。现代医学研究发现其发病原因可能与脑内代谢异常、Ca2+稳态失衡、炎症因子、胰岛素抵抗(IR)、Aβ1～42的过度表达、tau蛋白磷酸化、脑血管损伤、微血管、大血管病变及氧化应激与细胞凋亡等因素有关〔16〕。上述因素间的因果关系也是目前研究的热点问题，Winocur等〔17〕与Kamal等〔18〕研究发现IR在T2DM大鼠记忆力下降的过程中起着十分重要的作用〔17,18〕。糖代谢紊乱会导致TNF-α水平升高，Aβ1～42发生非酶糖基化，形成糖基化终末产物，最终导致神经细胞损伤，甚至影响中枢神经系统功能，从而引起认知功能损伤〔19〕。周莉等〔20〕研究也发现存在认知功能障碍的糖尿病患者较非认知功能障碍糖尿病患者血清Aβ1～42水平显著升高，说明Aβ1～42在T2DM患者体内的过度表达可能会导致T2DM认知功能障碍发病。

另一方面，炎症反应也是糖尿病患者认知功能减退的重要原因之一〔21〕，临床研究显示：血清IL-6和TNF-α水平升高是T2DM患者认知功能下降的一个重要危险因素〔22〕。TNF-α是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，当患者长期处于高血糖水平时，体内分泌的某些糖基化产物会激活巨噬细胞，使其分泌TNF-α，而过度表达的TNF-α会干扰胰岛功能及糖代谢，进而造成神经的损伤，导致认知功能障碍〔22〕；另一方面，TNF-α还可以透过血脑屏障，通过促进海马组织胰岛素受体丝氨酸磷酸化，促进认知功能障碍〔23〕。

本研究结果说明竹叶石膏汤对T2DM有较好的改善作用，这一结果与裴晶等〔24〕的报道一致，竹叶石膏汤可能通过抑制炎症因子的生成，改善糖尿病大鼠记忆力减退症状。意外的是，我们发现该方法诱导的T2DM大鼠海马Aβ1～42水平变化并不明显，竹叶石膏汤对海马Aβ1～42水平的变化也没有表现出明显的抑制作用，这可能与糖尿病发病时间较短的原因有关，同时也说明T2DM大鼠认知功能障碍发生初期主要与炎症反应有关。本实验还发现，竹叶石膏汤高剂量组空腹血糖及海马TNF-α水平均显著降低，但学习记忆能力却没有显著升高，推测可能是由于竹叶石膏汤中半夏的中枢神经麻醉作用所至〔25〕，有待进一步研究。