响应面法优化鸡小肠黏膜唾液酸提取工艺

胡玥明 孙桂菊 姚宏亮

摘要：[目的]优化鸡小肠黏膜唾液酸提取工艺，为肉鸡加工副产物开发再利用提供新思路。[方法]以鸡小肠黏膜为原料，以唾液酸提取量为指标，先采用单因素试验，在几种提取唾液酸常用酸中筛选最佳酸，进一步确定提取酸浓度、提取时间、液料比等3个因素影响唾液酸提取量的优化范围。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计方法，进行3因素3水平响应面优化设计，共进行17组处理，每组处理3次重复，考察柠檬酸浓度、提取时间、液料比等3个因素对唾液酸提取量的影响，从而确定鸡小肠黏膜唾液酸提取的最佳工艺参数。[结果]鸡小肠黏膜唾液酸提取最佳工艺参数为：柠檬酸浓度0.1molL，提取时间4h，液料比32.20：1（mLg）。考虑实际操作的简便，确定唾液酸提取的最佳工艺参数为：柠檬酸浓度0.1mol.L，提取时间4h，液料比30：1（mL：g＼）。在此条件下，得到的唾液酸提取量为（1010.39土21.87）Hg"g～，与预测值1025.694g*g无明显差异。[结论]通过响应面法优化了唾液酸提取工艺条件，提高了鸡小肠黏膜唾液酸提取量，为鸡小肠废弃物开发再利用提供新的思路。

关键词：响应面法;鸡小肠黏膜;唾液酸

中图分类号：TS201

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）06-0665-08

0引言

[研究意义]肉鸡加工过程中，鸡肠通常被当作加工副产物直接丢弃，不仅形成浪费，如处理不当，还会造成环境负担”。唾液酸是一类帶羧基的九碳化合物酰基衍生物的通称则，其最重要的2种形式为N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminicacid，Neu 5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（N-gylcolylneuraminicacidNeu5Gc）B。Neu 5Gc分布于猪、牛、羊等红肉食品中，鸡、鸭等禽类及鱼类中含有的唾液酸仅为Neu 5Ac研究证实，正常人体内含有的唾液酸仅为Neu 5Ac，Neu 5Ac在人体内发挥多种生物学功能，具有抗病毒、抗炎、提高学习记忆能力等多种作用，是对人体有益的唾液酸。人类对红肉食品的摄入是造成Neu 5Gc在人体内蓄积的主要途径，Neu 5Gc会加快癌症的进程，对人体健康造成有害影响。自然界中，燕窝是Neu 5Ac含量最高的天然物质，但燕窝价格高昂，对于大部分人而言，难以负担。因此，寻找安全廉价的唾液酸来源，意义重大。[前人研究进展]现阶段，对唾液酸的研究多集中于其生物学功E，研究证实其在抗病毒、抗炎及促进神经系统发育、提高学习记忆能力0-等方面发挥重要作用。唾液酸的制备方法主要有化学合成法、酶合成法、微生物发酵法和天然物提取法。前3种方法具有生产工艺复杂、经济成本较高等缺点。从天然原料中提取Neu 5Ac的方法，由于制备原料安全可靠无污染，且能实现某些物质的开发再利用，从而达到一定的经济效益，因此，对此法的研究近年来较为热门。刘静波等吗采用二次回归正交旋转组合设计，水解鸡蛋壳膜制备唾液酸的最佳工艺;陈璇等酶解猪小肠黏膜肝素加工废弃物，得到高唾液酸化的黏蛋白;范群艳采用响应面法，优化微波结合木瓜蛋白酶提取得到燕窝唾液酸的工艺。[研究切人点]目前，以鸡小肠黏膜为原料提取唾液酸尚未见报道。鸡小肠黏膜，可作为制备唾液酸的安全廉价来源，从而为鸡副产物的开发再利用提供新的思路。[拟解决的关键问题]本文拟通过单因素试验初步确定提取唾液酸的各因素水平，采用响应面优化试验，得到提取唾液酸的最佳工艺条件，从而为鸡小肠黏膜的开发再利用提供新的方向。

1材料与方法

1.1材料与试剂

鸡肠废弃物，常州立华食品有限公司;唾液酸标品，美国sigma公司;乙酸丁酯、丁醇，麦克林中国;三氯甲烷、甲醇、盐酸、硫酸、三氟乙酸、冰醋酸、柠檬酸、硫酸铜、间苯二酚等均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

SCIENTZ-10N，18ND冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司;H2050R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;IMS-20雪花制冰机，常熟市雪科电器有限公司;LS-1离心浓缩仪，湖南平凡科技有限公司。

1.3试验方法

1.3.1原材料的处理将收集到的鸡肠废弃物取小肠部分，匀浆，真空冷冻干燥去除水分。待樣品冻千后，用高速万能粉碎机粉碎成粉末，过50目筛，制得鸡小肠黏膜冻干粉备用。

1.3.2间苯二酚-盐酸法测定唾液酸标准曲线的建立唾液酸的测定方法主要有间苯二酚盐酸法、高效液相色谱法等，有研究表明，这2种方法测定的结果无明显差异。本研究采取间苯二酚盐酸法测定唾液酸含量，参考中国药典三部！唾液酸测定方法，将唾液酸标准品精确配制成5、10、20、40、60、80、100、1204g-mL的标准液待测液，分别取2mL于10mL试管中，同时用2mL超纯水作为空白对照，加人显色剂（用30%盐酸溶解3.1mg硫酸铜，2mg.氯化铬，0.1g间苯二酚，定容到50mL）2mL，振荡，于沸水浴中加热微沸15min，立即取出冰浴冷却到室温。向每管各加入4mL乙酸丁酯-正丁醇（85：15）萃取剂，旋涡混匀，静置10min，立即取上层提取液，于586nm处测吸光度。以OD值为纵坐标，以唾液酸质量浓度（ug*mL）为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3唾液酸提取量的确定准确称取0.1g鸡小肠黏膜冻干粉，加入体积比2：1：1的氯仿：甲醇：水混合液，旋涡混匀60min，4C15000rmin1混匀10min去除脂肪，取沉淀，分别以一定浓度一定体积的不同酸于80C下提取一定时间，然后立即放入碎冰中冷却以终止反应，4C15000r-min离心10min，取上清，旋千，复溶，按照1.3.2的方法测定吸光值，对照标准曲线，计算唾液酸提取量。

2.3.3响应面优化分析等高线和响应面图能反映各个因素之间的交互作用及各因素对响应值的影响。图6是A、B、C任意2个因素与唾液酸提取量之间的三维立体响应面图及其等高线在水平面，上的投影作出的平面图。响应面曲面的坡度能反映各因素及其交互作用对响应值影响的程度，曲面的坡度越陡，说明因素间的交互作用越强。等高线的形状及密度能反映是否存在交互作用，若等高线呈椭圆形，两因素间存在交互作用;若等高线呈圆形，则不存在交互作用叫。等高线图表明，柠檬酸浓度与液料比之间，提取时间与液料比之间存在交互作用。这与方差分析的结果一致，进一步验证了模型的准确性和可靠性。

2.3.4最佳提取工艺参数的确定与模型验证根据响应面优化分析结果，得到唾液酸提取的最佳工艺参数为：柠檬酸浓度0.1molL7'，提取时间4h，液料比32.20：1（mL：g'）时，唾液酸提取量最大，其预测值为1025.694gg'。为了实际操作的简便，将提取工艺参数调整为柠檬酸浓度0.1mol：L'，提取时间4h，液料比30：1（mL：g'）。试验重复3次，3次平行试验结果为（1010.39土21.87）4g*g～，与预测值接近，两者无明显差异。说明模型的拟合度良子，能准确预测唾液酸提取量，对实际应用具有参考价值。

3讨论与结论

鸡小肠黏膜唾液酸制备工艺，对肉鸡加工废弃物开发再利用有重要影响，能实现一定的经济效益。研究表明，鸡蛋壳膜吗、燕碎"等天然原料中能提取出唾液酸，寻找制备唾液酸的安全廉价原料来源引起研究者的广泛关注。本文以鸡小肠黏膜为原材料，以唾液酸提取量为指标，优化唾液酸提取工艺。酸水解法由于不具有专一性、释放唾液酸较彻底的优点，因此采用酸水解法提取唾液酸。提取酸、酸浓度、提取时间、提取温度、液料比等均是影响提取量的重要因素。试验结果显示，柠檬酸与盐酸、硫酸提取唾液酸的能力相近。柠檬酸作为常见有机酸，在提取过程中，没有像盐酸、硫酸一样，由于酸性过强，出现破坏唾液酸结构的情况。因此，提取唾液酸的最佳酸为柠檬酸，与袁玲的研究结果一致。酸浓度、提取时间、液料比等个因素对唾液酸提取工艺的影响较大，这3个因素影响唾液酸提取量能力大小依次为：液料比》提取时间》柠檬酸浓度。当溶剂对唾液酸的溶解达到饱和时，再增加溶剂的量，唾液酸提取量不会，上H，反而因其他水溶性物质的溶解增加，阻碍唾液酸的提取。另外，考虑到节约溶剂的使用，确定液料比30：1（mL：g）。提取时间过长，唾液酸在长时间的酸性环境下发生降解，唾液酸提取量反而下条。从提取工艺简便的角度出发，确定提取时间4h。柠檬酸浓度过高，酸性过强，不仅会波坏唾液酸结构，使提取率下降，还会引入更多的柠檬酸杂质，因此，确定柠檬酸浓度0.1molL。经响应面优化提取工艺后，得到的唾液酸含量为（1010.39士21.87）ugg'，与鸡蛋壳膜中的提取量相近。鸡小肠黏膜作为肉鸡加工废弃物，具有经济成本低、方便大量收集的优点，具有进一步开发利用的价值。

本文通过单因素试验确定柠檬酸为提取唾液酸的最佳用酸，在单因素试验的基础，上，采用Design-Expert8.0.6软件，对柠檬酸浓度、提取时间、液料比三因素进行响应面优化。在此基础上，考虑实际操作的简便易行，确定唾液酸提取的最佳工艺条件为：柠檬酸濃度0.1molL，提取时间4h，液料比30：1（mL：g'）。在此条件下，测得唾液酸提取量为（1010.39土21.87）yg'g'，与预测值基本相符，模型准确可靠，具有实际参考价值，为鸡小肠黏膜中唾液酸的提取提供了技术参考，从而为鸡肠废弃物的开发再利用开辟了新的方向。但鸡小肠黏膜唾液酸的纯化、结构鉴定等仍需进一步研究。

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（责任编辑：张梅）

胡玥明，孙桂菊，姚宏亮.响应面法优化鸡小肠黏膜唾液酸提取工艺[J].福建农业学报，2020，35（6）：665-672.