醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤昏迷治疗的量效关系

陈瑞奇,曾贵荣,石镇港,3,戚 麟,张妙红,袁湘中,徐永兴,王 平,张乐君*,洪 剑

(1.中南大学湘雅二医院,长沙 410011; 2.湖南省药物安全评价研究中心&新药药效与安全性评价湖南省重点实验室,长沙 410331; 3.湖南中医药大学,长沙 410208; 4.景德镇市第三人民医院,江西 景德镇 333000)

脑外伤是由于机械性外力作用于头部时发生的损伤,导致一个或多个病变,如颅内损伤、意识障碍或者死亡,其高发生率、致伤残率及死亡率已成为当今社会威胁人类生命安全的主要危险因素之一[1]。 醒脑静注射液源于安宫牛黄丸,由麝香、郁金、冰片、栀子组成,临床用于脑脉瘀阻所致中风昏迷,神志昏迷等。 临床研究表明醒脑静注射液对颅脑外伤有明显的治疗作用[2-4],但醒脑静注射液大剂量治疗颅脑损伤作用及不良反应未见报道。 本研究通过建立犬脑外伤致脑损伤昏迷模型,观察醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤昏迷的量效关系及不良反应,为临床研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Beagle 犬42 只,普通级,体重8～10 kg,购于北京玛斯生物技术有限公司[SCXK (京) 2016-0001]。在湖南省药物安全评价研究中心普通环境中饲养[SYXK (湘) 2015-0016],实验室温度范围:20℃～26℃、相对湿度范围:40%～70%、每日12 h/12 h 交替照明的饲养室,动物自由进食和饮水。 实验经湖南省药物安全评价研究中心伦理委员会批准,伦理审查编号:2018015。

1.2 主要试剂与仪器

醒脑静注射液,批号:180203,规格10 mL/支,由无锡济民可信山禾药业股份有限公司提供;0.9%氯化钠注射液,批号:20171112,湖南康源制药有限公司产品;陆眠宁,批号:20171221,吉林省华牧动物保健品有限公司产品;LABOSPECT003 型自动生化分析仪,日本日立公司产品;TD4 型低速离心机,南京普朗公司产品;MRI 核磁共振,西门子公司产品;B203LED 型生物显微镜,重庆奥特光学仪器有限公司产品;RM2235 型石蜡切片机、EG1150H+C 型组织包埋机、DFC 420C 型病理成像系统,均为德国Leica 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 脑外伤致Beagle 犬昏迷模型的建立[5-6]

雄性Beagle 犬42 只,体重8 ～10 kg,按体重随机分为正常对照组、模型对照组、醒脑静注射液剂量1 组(0.43 mL/kg)、剂量2 组(0.86 mL/kg)、剂量3 双次给药组((0.43+0.43) mL/kg)、剂量4 组(1.29 mL/kg)、剂量5 双次给药组((0.65+0.65)mL/kg),采用陆眠宁(0.02 mL/kg)麻醉,将麻醉犬固定在自制打击器中,打击器高度150 cm,打击器重量3.8 kg,将打击器置于150 cm 处,垂直打击犬颅脑枕部,连续打击4 次,建立犬外伤脑损伤昏迷模型。 造模后随即给予不同剂量醒脑静注射液,给药体积10 mL/kg,随后进行脑部核磁共振检测,各组连续给药14 d,末次给药后麻醉犬,采血进行生化检测、取相关组织进行组织病理学检查。

1.3.2 检测指标

(1)动物苏醒时间测定:首次给药结束后将放犬置于笼内,笼外采用高清摄像头进行监控,记录首次给药后至动物苏醒时间,苏醒以犬前爪翻正反射恢复作为判断标准。

(2)脑部核磁共振检测:采用核磁共振检测造模后和末次给药后犬脑组织损伤情况。

(3)血清NSE、S-100B 含量检测:用ELISA 试剂盒于576 nm 波长检测造模后及末次给药后血清NSE、S-100B 含量。

(4)血常规、肝肾功能检测:末次给药后取血检测各组犬肝功能(ALT、AST、TBil)、肾功能(BUN、GRE)及血常规。

(5)组织病理学检查:末次给药后取犬心、肝、脾、肺、肾、脑组织枕部,10%福尔马林固定,常规切片,HE 染色,显微镜下观察组织病理学改变。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 进行统计分析,统计学意义的水平设定为P＜0.05,计量资料采用平均数±标准差( ¯x ±s)表示,用Leven’s test 方法检验正态性和方差齐性,评价时考虑统计学差异和生物学意义。

2 结果

2.1 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤模型苏醒时间的影响

如表1 所示,与正常对照组比较,模型对照组犬苏醒时间明显增加(P＜0.01)。 与模型对照组比较,醒脑静注射液剂量1 组、剂量2 组(单次给药)、剂量3 组(2 次给药)犬苏醒时间明显减少(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.2 醒脑静注射液对血清S100B、NSE 含量的影响

如表2 所示,与正常对照组比较,造模后各组犬血清S100B、NSE 含量明显升高(P＜0.01);给药结束后模型对照组犬血清S100B、NSE 含量明显升高(P＜0.05)。 与模型对照组比较,醒脑静剂量1 组、醒脑静剂量2 组、醒脑静剂量4 组血清S100B、NSE含量明显降低(P＜0.05)。

2.3 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤模型损伤面积的影响

如表3、图1 所示,脑组织核磁共振检测结果表明,与正常对组比较,造模后各组脑损伤面积均明显增加(P＜0.01),给药14 d 后,与模型对照组比较,醒脑静剂量1、剂量2、剂量3(2 次给药)、剂量4、剂量5(2 次给药)组犬脑核磁共振检测损伤恢复面积明显增加(P＜0.01)。

2.4 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤致昏迷模型血常规的影响

如表4 所示,与正常对照组比较,模型对照组犬血常规嗜酸性粒细胞数目明显升高(P＜0.05),其余指标无明显差异。 与模型对照组比较,醒脑静注射液剂量1 组、2 组犬血常规淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目明显降低(P＜0.05);醒脑静注射液剂量1 组犬单核细胞数目明显降低(P＜0.05);醒脑静注射液剂量4、5 对犬血常规无明显影响。

表1 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤模型苏醒时间的影响( ¯x±s,n=6)Table 1 Effects of xingnaojing injection on the recovery time of beagle dogs

表2 醒脑静注射液对血清S100B、NSE 含量的影响( ¯x±s,n=6)Table 2 Effects of xingnaojing injection on S100B and NSE in serum

表3 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤模型损伤面积的影响( ¯x±s,n=6)Table 3 Effects of xingnaojing injection on the area of traumatic brain injury in dogs

表4 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤致昏迷模型血常规的影响( ¯x±s,n=6)Table 4 Effects of xingnaojing injection on routine blood findings of dogs

图1 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤模型损伤面积的影响Figure 1 Effects of xingnaojing injection on injury area in beagle canine model of cerebral trauma

2.5 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤致昏迷模型肝肾功能的影响

如表5 所示,与正常对照组比较,各组肝肾功能指标(ALT、AST、TBil、BUN、CRE)未见明显差异;与模型对照组比较,醒脑静注射液各给药组对肝肾功能指标(ALT、AST、TBil、BUN、CRE)无明显差异。

2.6 组织病理学检查

末次给药后,麻醉动物解剖取各组动物心、肝、脾、肺、肾、脑器官进行组织病理学检查,光镜下观察。 大体观察结果显示,正常对照组、模型对照组及各给药组脏器未见明显差异。 显微镜观察结果显示,正常对照组、模型组及各给药组脏器未见明显病理改变,见图2～7。

3 讨论

脑外伤可致伤残,引起脑部出血、水肿,以及神经意识障碍,严重时可导致死亡[7]。 神经标志物S100B 和NSE 在脑损伤时迅速通过受损的血脑屏障进入血清中。 NSE 主要存在于中枢神经系统的神经元和神经内分泌细胞中,当神经元损伤时,NSE从细胞内进入脑脊液中,通过损伤的血脑屏障进入血液中,使血液中NSE 浓度升高[8-9]。 正常机体情况下,S100B 参与细胞增生、分化、和细胞凋亡等过程,血清中含量较少,发生脑外伤时,血脑屏障被破坏,S100B 入血,使血清中S100B 含量大大增加[10]。S100B 的过度表达可能是脑损伤的代偿反应[11-12]。本研究结果显示醒脑静注射液能明显降低脑损伤犬血清S100B、NSE 含量。 目前对脑损伤程度诊断方法以影像学检查结果为主,核磁共振可以准确的观察到脑损伤部位,以及计算脑损伤面积[13]。 脑外伤在进入稳定期后,如果能够及时给予患者有效的治疗,便能够最大程度修复患者的受损细胞,帮助神经恢复正常的功能,有效改善预后,本研究结果显示醒脑静注射液能明显增加脑损伤恢复程度。提示醒脑静注射液对外伤致脑损伤有一定的改善作用。

表5 醒脑静注射液对Beagle 犬脑外伤致昏迷模型肝肾功能的影响( ¯x±s,n=6)Table 5 Effect of xingnaojing injection on liver and kidney function in canine traumatic brain injury model

图2 犬心脏组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 2 Histopathological examination of canine heart. HE staining

图3 犬脑组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 3 Histopathological examination of canine brain. HE staining

图4 犬肝脏组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 4 Histopathological examination of canine liver. HE staining

图5 犬脾组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 5 Histological examination of spleen in dogs. HE staining

图6 犬肺组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 6 Histopathological examination of canine lungs. HE staining

图7 犬肾组织病理学检查(HE 染色,× 200)Figure 7 Histopathological examination of canine kidney. HE staining

醒脑静注射液具有开窍醒脑,增强耐缺氧、保护脑损伤等作用[14],内含有麝香、冰片、郁金、栀子等,其中麝香和冰片可以改善血脑屏障通透性,维持内环境稳定,减轻脑水肿,同时可减少脑组织损伤[15];醒脑静注射液可以有效降低颅内压,同时提高脑灌注压,可以减少脑外伤昏迷苏醒时间。 醒脑静注射液可通过血脑屏障直达中枢神经系统,因此可以清除氧自由基,保护并修复受损的神经细胞,还能够抑制血管痉挛,改善受损脑部缺血缺氧的状态,消除水肿[16-17]。 本实验研究结果表明醒脑静注射液能明显减少Beagle 犬脑外伤昏迷苏醒时间,且能明显改善造模后脑损伤恢复面积,大剂量使用醒脑静注射液对血常规、肝肾功能无明显影响,且对动物心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、等器官组织病理学无明显影响,提示大剂量醒脑静注射液无明显的毒副作用。

综上所述,醒脑静注射液能明显改善Beagle 犬脑外伤致昏迷和脑损伤程度,且大剂量使用无明显的毒副作用。