帕金森病小鼠CatWalk 行为学研究
2020-11-09张子龙刘思含姚继红周俊俊
张子龙,刘思含,姚继红,周俊俊
(大连医科大学药学院,辽宁 大连 116044)
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是继阿尔茨海默病后第二常见的中枢神经系统退行性疾病,是由中脑黑质纹状体区域的多巴胺能神经元变性导致的多巴胺(Dopamin,DA)神经递质缺失引起的一种普遍性运动障碍[1]。 随着PD 的进展,PD 患者的步态变异性和姿势不稳定性显著呈现[2],节律性行走时会受到短步长和低速度的阻碍,这些都与多巴胺水平的降低密切相关[3]。 常见的帕金森病症状包括静置性震颤,运动迟缓、僵硬,失去姿势反射等[4],其中步态紊乱是帕金森病最常见的运动问题之一。 患有PD 的患者通常表现出弯腰姿势和步态改变、步幅长度和总体速度减少、双肢支撑增加、在摆动阶段足部间隙减小,以及节奏变快导致跌倒的可能性增大[5]。 渐进性步态障碍与姿势不稳定最终往往剥夺了患者的运动能力和日常生活能力[6]。
近年来,为了弥补药物诱导的行为学测试方法存在的种种缺陷,满足日益增长的基础研究需求,诸多非药物诱导的行为学测试方法相继被应用于PD 模型的测试与评价[7]。 其中步态分析方法已然成为研究PD 严重程度的重要方法[8]。 常用的步态分析方法包括:评估步行速度、摆动和站立时间的跑步机运动测试[9];评估前肢使用不对称性的气瓶测试和评估运动起始状态的前肢运动不能测试[10-11];此外,还有旷场测试[12-13]、旋转测试[14-15]、游泳测试[16]和筑巢测试[17]等。 然而,这些测试只能单一测量步态的动态或静态变化,可观察到的变化通常较弱。 而且这些测试的指标大多应用于单侧损伤的动物,因此不足以证明双侧受伤动物模型的功能缺陷。 而CatWalk 计算机辅助步态分析系统提供了一种评估步态功能的自动方法,它可以同时测量大量的动态和静态步态参数[18],并且可以检测出对于啮齿动物研究特别有价值的肢间协调的空间指标与时间指标。 本研究中我们应用CatWalk 步态分析仪来验证和评估MPTP 诱导的双侧病变PD小鼠模型的步态变异性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
6～8 周龄雄性C57BL/6 J 小鼠,20 只,SPF 级,体重22 ～25 g,由大连医科大学SPF 实验动物中心提供[生产许可证:SCXK (辽) 2013-0003;使用许可证:SYXK (辽) 2013-0006]。 动物实验经大连医科大学伦理委员会同意,并在实验动物饲养和使用中严格遵守“减少、替代和优化”3R 原则给予人道关怀。 饲养条件:温度21℃～23℃,相对湿度30%～60%,12 h 照明/黑暗交替的环境。
1.2 主要试剂与仪器
MPTP,购自美国sigma 公司;CatWalk 小动物步态分析仪:CatWalk XT,Noldus,荷兰。
1.3 实验方法
1.3.1 MPTP 诱导小鼠PD 模型建立
PD 造模方法:将雄性C57BL/6 小鼠随机分为:空白对照组、MPTP 模型组。 动物适应性喂养7 d后,每只腹腔注射给予MPTP 30 mg/kg,连续5 d。空白组给予相应体积的生理盐水。
1.3.2 动物一般情况监测
实验期间,每天观察动物一般情况:包括进食、体重等变化。
1.3.3 步态分析实验
本实验用来评价小鼠的自然运动行为及运动协调性。 采用小动物步态分析仪(CatWalk XT,Noldus,荷兰)检测,实验前训练3 d。 检测时使小鼠自由穿过设定长度的检测通道,利用内光源脚印折射技术对摄像头拍摄视频中的足印进行高效的计算机处理,在自然行走情况下评估小鼠运动情况。此过程全部在暗室环境内完成,每只小鼠至少接受三次检测。
1.4 统计学方法
使用SPSS 17.0 软件(SPSS Inc.,Chicago,USA)分析数据。 所有数据均表示为平均数±标准差( ¯x ±s)。 两组间比较采用t 检验。 P＜0.05 被认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 CatWalk 采集小鼠步态图形变化
为了评价MPTP 诱导PD 模型损伤后小鼠运动协调性变化,我们应用CatWalk 系统检测了小鼠步态变化,捕获大量代表性动态视频和图片(图1)。从图中我们可以看出,空白对照组小鼠脚步以交替型为主,且步幅大小均一、步数稳定;MPTP 模型组小鼠脚步模式混乱、步态紊乱异常、步幅大小不一,三点支撑的增加明显。
2.2 CatWalk 步态参数测定结果
经分析发现:模型组与空白对照组相比,通过某特定距离的时间(run duration)、最大速率变化(maximum variation)、支撑相时间(stance)、脚步周期(step cycle)显著增加,平均速度(average speed)、单位时间脚步数(cadence)、 摆动速度(swing speed)、步幅(stride length)显著降低(图2、图3)。上述8 项指标变化差异均有统计学意义(P＜0.05)。
图1 小鼠步态变化对比结果Figure 1 Comparison of gait changes in mice
图2 PD 小鼠定量性速度相关指标变化Figure 2 Changes in quantitative speed-related indicators of PD mice
图3 PD 小鼠定量性爪印指标变化Figure 3 Changes in quantitative paw print indicators of PD mice
3 讨论
为了对MPTP 诱导的PD 小鼠进行更为直观且无创的行为学评估,在本实验过程中引入了CatWalk 动物步态分析技术。 实验结果显示,和空白对照组相比,MPTP 诱导的模型组小鼠运动迟缓、运动协调能力显著下降,表现为通过某特定距离的时间(run duration)、 最大速率变化(maximum variation)、支撑相时间(stance)、脚步周期(step cycle)显著增加,平均速度(average speed)、单位时间脚步数(cadence)、摆动速度(swing speed)、步幅(stride length)显著降低。 以上结果表明,CatWalk动物步态分析技术能够敏锐地捕捉到PD 小鼠的步态平衡障碍和肢内协调缺陷。
行动迟缓是PD 的主要行为学标志之一,摆动速度、步幅、脚步周期等都是与移动性分析相关的参数。 PD 小鼠模型的步幅和摆动速度明显降低,可能是由于MPTP 作用诱导小鼠肌肉僵硬和运动功能减退所导致的结果,这与PD 患者的症状基本一致[19],小鼠脚步周期的增大主要是由于爪和玻璃板之间的接触较长,该参数的变化也同样与双侧6-OHDA 大鼠模型的步态评估结果相吻合[20]。 而PD模型小鼠在单位时间脚步数明显减少,则是由于小鼠步幅的减少并不能抵消步行周期的增大所致。同时,MPTP 诱导损伤后,还表现出摆动速度降低和支撑相时间的延长。 这些指标变化进一步说明了Catwalk 步态分析参数可反映PD 小鼠出现步态紊乱和步态平衡障碍。
在本项研究中,CatWalk 提供了对MPTP 模型小鼠在运动方面实时、精密且全面的分析,揭示了MPTP 诱导的PD 小鼠模型的步态变化。 相比于其他常用PD 模型检测方法,如自主活动仪、滚筒法等,CatWalk 的使用更为便捷、检测数据更为可靠、对小鼠的训练更为简单、且不会对模型小鼠造成任何损伤。 更重要的一点在于CatWalk 系统可以同时、全面地测量步态的动态和静态相关参数,并且参数与PD 行为学变化有较强的对应关系。 在以PD 为代表的神经系统退行性疾病动物模型的相关研究实验中,CatWalk 检测系统以其独特优势,应用将会越来越广。
