高效液相色谱联用质谱法测定羊奶粉中的氯酸盐和高氯酸盐

许小茜 李清清 顾颖娟

(上海质量监督检验技术研究院，上海 200233)

作为近年新兴发展起来的奶粉品类，与牛奶粉相比，羊奶粉成分组成与母乳更为接近，并具有牛奶粉所不具备的优势特征：脂肪结构与母乳相似，碳链短，且含有较低的α-酪蛋白，人体易消化吸收；含有8种人体必需的氨基酸；含有更多Ca、P、Mg、Cu等矿物元素；富含DHA、核苷酸及脑磷脂等，可促进人体大脑神经和视力发育；特有的上皮细胞生长因子(EGF)，可促进对肌肤粘膜损伤的修复，超氧化物歧化酶可起到清除自由基、抗衰老等美容作用[1-3]。近年来，在羊奶的营养价值及生物功能领域开展了大量的临床研究，羊奶及其制品正逐渐成为婴幼儿、特别是不能耐受牛奶及患有胃肠道疾病的婴幼儿，甚至作为老年人和营养不良患者的良好乳源。

氯酸盐和高氯酸盐是一种持续性的环境污染物。高氯酸盐可以竞争性结合钠/碘转运体(NIS)从而干扰人体正常代谢；氯酸盐是饮用水消毒产生的副产物，影响人体的血液系统和甲状腺系统，从而影响人体健康。在食品的生产、包装过程中，为抑制微生物的生长繁殖，工厂生产线的清洁消毒过程中极易引入高氯酸盐和氯酸盐，且难以清除干净[4-6]。因此研究开展羊奶粉中氯酸盐和高氯酸盐的定量分析具有重要意义。

目前，测定氯酸盐和高氯酸盐的方法主要有离子色谱电导法[7-9]、离子色谱-串联质谱法[10-13]和高效液相色谱串联质谱法[14-16]等。其中离子色谱电导法是检测饮用水中高氯酸盐的主流方法， 但该方法易受基质中较高浓度的氯离子和硫酸根离子干扰，难以准确地对样品中的高氯酸盐进行定性、定量分析。另一方面离子色谱法灵敏度较低，对含量较低的样品无法有效检测。离子色谱-串联质谱法克服了离子色谱电导法的不足，但其流动相多为无机酸碱，不适合直接进入离子源，需经过抑制法转换成H2O，检测成本较高，操作复杂，且离子色谱仪与质谱仪的联用设备较少且价格昂贵，难以普及。此外，如果是检测奶粉中的氯酸盐和高氯酸盐含量，需要用有机试剂进行沉淀蛋白，过高的有机试剂对离子色谱的基线有严重影响。高效液相色谱联用质谱法具有良好的灵敏度和选择性，且设备普及更为广泛，方法利于推广应用。

本研究拟采用高效液相色谱-串联质谱法对羊奶粉中的氯酸盐和高氯酸盐的含量进行测定，同时结合同位素内标对结果进行修正，减少样品基质对目标物的干扰，建立高效、灵敏度高、稳定性好的检测方法。

1 实验方法

1.1 材料

被测羊奶粉总共79个批次，其中1段奶粉30批次，2段奶粉29批次，3段奶粉20批次。

1.2 仪器与试剂

TQ-XS高效液相色谱-串联质谱仪(Xevo TQ-XS,美国Waters公司)；超纯水发生器(Milli-Q，美国Milli-Q公司)；旋涡振荡仪(D-91126 Schwabach，德国Heidolph公司)；高速离心机(Centrifuge 5804，德国Eppendorf公司)；超声波清洗器(SK8210LHC，上海科导超声仪器有限公司)；Waters 0asis PRiMEHLB固相萃取柱(Waters 0asis PRiMEHLB，3cc，150mg，美国waters公司)。

超纯水(质谱级，Fisher)；乙腈(质谱级，TEDIA)；甲醇(质谱级，Fisher)；甲酸铵(质谱级，ACS)；甲酸(质谱级，ACS)；氯酸盐标准溶液(有证标准物质，O2Si)；高氯酸盐标准溶液(有证标准物质，CIL)；氯酸盐同位素内标溶液(有证标准物质，EURL-SRM)；高氯酸盐同位素内标溶液(有证标准物质，CIL)。

1.3 工作曲线的配制

取高氯酸盐标准溶液和氯酸盐标准溶液配制高氯酸盐和氯酸盐混标浓度分别为1.00ng/mL、2.50ng/mL、5.00ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL， 2.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL。混合标准工作液中氯酸盐-18O3、高氯酸盐-18O4浓度分别为15.0ng/mL、2.0ng/mL。临用新制。

1.4 样品前处理

准确称取试样2g(精确到0.001g)，置于50mL具塞离心管中，加入100μL混合同位素内标液，再加入5mL0.1%(v/v)甲酸水溶液，迅速混匀，置于45℃水浴超声20min，涡旋振荡5min，再准确加入10mL乙腈，混匀，于10000r/min下常温离心10min，取上清液待净化。

取3mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱，并接上0.22umMCE混合纤维素酯膜，收集滤液，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：Thermo Acclaim TRINITY P1(50mm×2.1 mm,3μm)；柱温：30℃；进样体积：3μL；流速：0.4 mL/min；A相为20mmol/L甲酸铵溶液，B相为乙腈(质谱级) 梯度淋洗条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.6 质谱条件

离子源：电喷雾电离ESI(-)；毛细管电压：2.0kV；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气流量800L/h；锥孔气流量：150L/h；采用多反应监测模式采集数据。质谱参数见表2。

表2 氯酸盐和高氯酸盐的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

奶粉样品基质复杂，富含蛋白质，所以在本方法中比较了甲醇和乙腈对蛋白质的沉淀效果。发现使用甲醇作为沉淀蛋白的有机溶剂时，净化后的样品溶液放置过夜后，瓶底有晶体析出，进样前需要进行二次净化，对仪器中进行大批量样品过夜进样的情况有堵塞进样针的风险。改用乙腈作为沉淀蛋白的有机溶剂，样品溶液放置几天仍可保持澄清，未出现沉淀物。因此在前处理过程中采用5mL0.1%甲酸水溶液超声提取20min后，加10mL乙腈沉淀蛋白质。

2.2 液相色谱条件的优化

2.2.1流动相甲酸铵浓度的选择。

甲酸铵的浓度在10～30mmol/L时，氯酸盐和高氯酸盐的峰形良好，差别不明显。随着甲酸铵浓度增大，保留时间往前漂移。考虑到流动相中盐浓度对质谱仪器的影响及选择合适的保留时间，最终选取浓度为20mmol/L的甲酸铵溶液为流动相。同时将3.5min后的流动相通过六通阀切换至废液(图1～图3)。

2.2.2流动性乙腈级别的选择。

实验过程中发现，随着进样次数的增加，基线会慢慢变高，导致样品相应信号部分被覆盖。流动相里的杂质会严重污染整个流路及离子通道乃至四级杆。因此采用质谱级乙腈替代色谱级乙腈作为流动相，可以明显降低基线，且延长色谱柱的寿命(图4、图5)。

图1 浓度为10mmol/L甲酸铵溶液，氯酸盐和高氯酸盐的保留时间

图2 浓度为20mmol/L甲酸铵溶液，氯酸盐和高氯酸盐的保留时间

图3 浓度为30mmol/L甲酸铵溶液，氯酸盐和高氯酸盐的保留时间

图4 采用色谱级乙腈作为流动相

2.3 线性范围、线性方程与检出限

氯酸盐线性方程为Y=0.0307302X+0.00184822，相关系数为0.9998，在2.0～100.0μg/L范围内线性关系良好；高氯酸盐线性方程为Y=0.100267X+0.105331，相关系数为0.9998，，在1.0～50.0μg/L范围内线性关系良好。以S/N=3确定本方法中氯酸盐的检出限为4.5μg/kg，高氯酸盐的检出限为3.0μg/kg，以S/N=10确定氯酸盐的定量限为15.0μg/kg高氯酸盐的定量限为7.5μg/kg，可满足羊奶粉中对氯酸盐和高氯酸盐的检测要求。

2.4 方法的回收与精密度

取空白奶粉样品，加入15.0、30.0、150μL混合标准溶液(1.4.1)，按实验方法测定氯酸根和高氯酸盐含量，重复测定7次，计算其回收率和精密度。结果见表3，满足实验要求。

表3 羊奶粉中氯酸盐和高氯酸盐的回收率及相对标准偏差(n=7)

续表3

2.5 实际样品的测定

采用本方法检测了79种婴幼儿羊奶粉中的氯酸盐和高氯酸盐。结果表明，大多数样品中均检出氯酸盐和高氯酸盐。其中1段羊奶粉氯酸盐含量范围在19.5～290μg/kg之间，高氯酸盐含量范围在9.50～185μg/kg之间；2段羊奶粉氯酸盐含量范围在19.1～617μg/kg之间，高氯酸盐含量范围在9.89～409μg/kg之间；3段羊奶粉氯酸盐含量范围在31.9～469μg/kg之间，高氯酸盐含量范围在36.6～286μg/kg之间。

3 结论

本研究成功建立并优化了液相色谱-串联质谱联用法检测羊奶粉中氯酸盐和高氯酸盐含量的方法，方法优化了样品的提取方法，液相色谱条件。灵敏度高，结果稳定，其中氯酸盐检出限为4.5μg/kg，定量限为15.0μg/kg，方法的准确度(加标回收率为95.7%～107.2%)，精密度(RSD为1.43%～3.66%)；高氯酸盐检出限为3.0μg/kg，定量限为7.5μg/kg，方法的准确度(加标回收率为96.1%～108.6%)，精密度(RSD为2.46%～4.04%)。均能很好地满足羊奶粉中氯酸盐和高氯酸盐的分析要求，在实际工作中具有较强的实用性，具有较高的应用价值。