液相色谱-串联质谱法测定餐具洗涤产品中的姜酚和姜烯酚
2020-11-09陈意光张沛林谭焯针王宏海夏泽敏谭建华
陈意光 张沛林 谭焯针 王宏海 夏泽敏 谭建华
(广州质量监督检测研究院， 广州 511447)
生姜具有解毒止呕、镇痛消炎、营养保健、抗菌、抗氧化作用，在医药、保健、食品、化妆品等领域都具有较高的应用价值[1-5]。生姜的化学成分很复杂，目前已发现的成分就有140多种。研究表明，姜辣素是生姜的主要功效成分。姜辣素的分子式中均有3-甲氧基-4-羟基苯基的官能团，根据此官能团连有脂肪链的不同分为姜酚类(gingerols)、姜烯酚类 (shogaols)、姜酮 (zingerones) 、姜二酮类(zingerdiones)和姜二醇类(ginerdiols)等类型[3]。姜酚呈黄色油状液体，是一类6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等的混合物(图1)。姜烯酚在生姜中的含量较低。
目前针对姜酚和姜烯酚的检验方法主要是采用高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法。检测基质包括生姜、生姜提取物、食品等[5-11]。国内执行标准包括GB//T22293-2008《姜及油树脂主要刺激成分测定 HPLC法》[11]。在餐具洗涤剂产品质量比对项目调研中，可见部分产品标示添加姜成分，但是目前国内尚未有洗涤剂中姜酚和姜烯酚的检测方法，企业和消费者均无法得知餐具洗涤产品是否存在姜成分，含量有多少。因此建立餐具洗涤产品中姜酚，姜烯酚的检测方法，对维护消费者权益，开拓姜产品应用领域，并为企业把控产品质量，形成国际竞争力提供重要技术支撑，十分必要。
图1 6种化合物的化学结构
1 材料与方法
1.1 试剂，仪器和样品
1.1.1试剂和仪器
6-姜酚(6-Gingerol，CAS 23513-14-6，纯度98%)；8-姜酚(8-Gingerol，CAS 77398-92-6，纯度99%)；10-姜酚(10-Gingerol，CAS 107257-18-1，纯度99%)：标准品，Stanford Chemicals； 6-姜烯酚(6-Shogaol，CAS 23513-13-5，纯度97%)，8-姜烯酚(8-Shogaol，CAS 104186-07-4，纯度90%)，10-姜烯酚(10-Shogaol，CAS 104186-05-2，纯度90%)：标准品，Standard。
乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷：色谱纯，美国Fisher；甲酸：色谱纯，德国CNW；无水硫酸钠、25%氨水、正丁醇：分析纯，广州化学试剂厂；硅胶小柱：2g, 6mL，德国CNW，使用前先用6mL酸化二氯甲烷活化；超纯水：实验室自制。
液相色谱-串联质谱仪：Ulti mate 3000-TSQ Quantiva，美国Thermo fisher Scientific公司；涡旋混合仪：MinishakerMS3 digital，德国IKA公司；超声波清洗仪：SK8200H，上海科导超声仪器公司；氮吹浓缩仪器：EFAA-DC24-RT，上海安谱公司；离心机：Mini Spin，德国Eppendorf公司；天平：CPA225D和BSA224S，瑞士Sartorius公司；超纯水仪：Mill-Q，美国Merck millipore公司。
1.1.2材料
共20份样品来源于不同品牌，购自广州本地商场。其中样品1到样品4用于加标实验。
1.2 实验方法
1.2.1标准溶液的配制
标准储备溶液：分别称取标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，摇匀，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，-20℃存放。
标准中间液1：移取1mL标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，摇匀，配制成浓度为10mg/L的标准中间液，-20℃存放。
标准中间液2：移取1mL标准中间液1于10mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，摇匀，配制成浓度为1000 μg/L的标准中间液，使用前配制。
工作液：将标准中间液2用甲醇逐级稀释，配制成浓度分别为0、4.0、8.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0μg/L的标准工作液，使用前配制。
1.2.2溶液配制
提取液：移取10mL甲酸，10mL甲醇溶液到1L容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度。
酸化二氯甲烷溶液：移取10mL甲酸溶液到1L容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度。
洗脱溶液：移取10mL甲酸溶液到1L容量瓶中，加入100mL丙酮，用二氯甲烷定容到刻度。
流动相A：移取10mL正丁醇，0.1mL氨水到1L容量瓶中，用水定容到刻度。
流动相B：移取10mL正丁醇，0.1mL氨水到1L容量瓶中，用乙腈定容到刻度。
1.2.3仪器条件
色谱柱: Waters Acquity BEH-C18 1.7μm，2.1 mm50 mm；流速：0.3 mL/min；柱温: 30℃；进样体积：3L。流动相梯度洗脱程序：0min，35%B，1min，35%B，5min，80%B，7min，80%B，7.5min，35%B，10min，35%B。
ESI离子源，负离子模式；喷雾电压：3000V；鞘气：50Arb，辅助气：10Arb；离子源温度：280℃，传输管温度300℃。选择反应监测(SRM)，各化合物监测离子对信息见表1；离子对驻留时间：软件自动设定。
1.2.4样品前处理
称取1.0g样品于15mL塑料离心管中，加入10mL提取液，涡旋混匀，加入3g无水硫酸钠，再次涡旋混匀后，于离心机6000rpm离心5min。取2mL提取液于预先活化的硅胶小柱，待自然流干后，加入2mL洗脱溶液，自然流干。上柱液和淋洗液均弃去。再加入5mL洗脱溶液，完全收集于氮吹试管中。40℃氮气吹干后，用0.5mL甲醇溶解残渣，溶液过0.22μm有机滤膜后待测。
表1 6种化合物的保留时间和离子对参数
注1：定性离子峰高与定量离子峰高的比值
1.2.5实验结果计算
样品中含量按式(1)计算。
(1)
其中：c为样品上机溶液从工作曲线计算得到的浓度，μg/L；V为定容体积，mL；m为称样量，g；
1.2.6加标实验
对4种样品做标准添加实验，其中样品1添加10μg/kg、80μg/kg、400μg/kg 3个浓度，样品2、样品3、样品4添加80μg/kg 1个浓度。根据测定结果计算平均回收率和相对标准偏差。
2 结果与讨论
2.1 实验条件的优化
2.1.1前处理条件的优化
由于姜酚和姜烯酚在二氯甲烷中有较好的溶解性，方法采用添加少量甲酸和甲醇的二氯甲烷提取，可以增加二氯甲烷的萃取效率，并用硫酸钠脱水，经过离心处理后，可去除基质中的水、亲水性物质和部分表面活性剂。
由于表面活性剂具有极性基团，实验采用硅胶小柱吸附表面活性剂，并考察了丙酮、二氯甲烷+丙酮=9+1，二氯甲烷3种洗脱溶剂(洗脱体积为6mL)的净化效果。结果表明采用丙酮为洗脱溶剂，经净化后的样品仍然有较强的基质效应，未能实现净化效果。采用二氯甲烷作为洗脱液，姜酚和姜烯酚未能洗脱。采用二氯甲烷+丙酮=9+1可以将样品中的大部分基质效应去除，各化合物回收率接近100%。实验最终采用二氯甲烷+丙酮=9+1作为洗脱溶剂。采用丙酮和二氯甲烷+丙酮=9+1两种洗脱溶剂的基质效应见表2，基质效应以浓度为40μg/L空白基质标准溶液和标准溶液中化合物的峰面积百分比表示。ND表示受基质抑制，未出峰。
表2 6种化合物在两种洗脱溶液中的基质效应
实验进一步比较了3mL、4mL、5mL、6mL、7mL5种洗脱体积。洗脱体积在3mL时，姜酚和姜烯酚未洗脱；4mL开始有姜酚和姜烯酚被洗脱；至6mL，各化合物的响应不再增加。实验最终确定洗脱液接收体积为第3mL到第7mL，共收集5mL。
2.1.2仪器条件的优化
6种化合物在乙腈-水体系中可以实现分离。氨水的添加可以显著的提高化合物的离子化效率，各化合物响应可显著提高。正丁醇的加入可以在此基础上更进一步提高各化合物的响应。实验比较了0.2%、0.5%和1.0%的正丁醇添加量，结果表明1.0%的正丁醇响应最高。考虑到更高浓度的正丁醇会提高流动相的沸点和粘度等性质，未再提高正丁醇浓度。
采用超高效液相色谱柱，梯度洗脱条件经优化后，6个化合物在十分钟的色谱时间实现完全分离，各化合物峰型尖锐，峰宽约0.2min。
化合物母离子的离子源条件通过TSQ Quantiva 2.0 Tune软件人工优化得到，子离子选择和碰撞能通过TSQ Quantiva 2.0 Tune软件自动优化得到。
2.2 实验结果
2.3.1仪器检出限，方法检出限，工作曲线
在本实验条件下，工作曲线、仪器检出限(定性离子信噪比为S/N=3所对应的标准溶液浓度)及对应的方法检出限见表3，工作曲线见表3。6种成分在测定范围内与色谱峰峰面积均呈良好的线性关系，且该方法具有较高的灵敏度。标准溶液色谱图见图2。
表3 6种化合物的工作曲线和检出限
图2 160 μg/L标准溶液定量离子对色谱图
2.3.3方法的准确性和精密度和检测限
在不同基质的加标回收实验中，方法回收率实验结果见表4。方法的平均回收率在86.6%到118.3%之间，相对标准偏差在0.7%到6.1%之间。方法的准确性和精密度好。阴性样品加标色谱图见图3。
图3 10.0μg/kg加标样品定性离子对色谱图
表4 在4个基质中的添加回收结果
续表4
续表4
2.3.4洗洁精样品中姜酚和姜烯酚的检测
研究小组采用本方法对20批洗洁精样品中姜酚和姜烯酚含量进行测定。结果显示，1批次样品检出姜酚和姜烯酚，结果分别为6-姜烯酚65.2μg/kg，6姜酚100.7μg/kg，8-姜烯酚18.8μg/kg，8-姜酚20.1μg/kg，10-姜烯酚38.1μg/kg，10-姜酚38.5μg/kg。
3 结论
本实验首次采用硅胶小柱净化，液相色谱-串联质谱法测定洗洁精产品中的6种姜酚和姜烯酚。方法灵敏度高，准确性好，精密度高，通用性好。是检测洗洁精产品中姜特征成分的合适方法。对维护消费者权益，开拓姜产品应用领域，并为企业把控产品质量，形成国际竞争力提供重要技术支撑。对其他洗涤产品中姜酚、姜烯酚的检测有一定的参考意义，具有较好的应用前景。
