金华地区非小细胞肺癌基因突变情况回顾性研究

王斌峰 马拥军 游霞 陈相剑 符芳妮 宇兆男

美国国家综合癌症网络（NCCN）指南推荐的非小细胞肺癌需进行的基因检测范围包括EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、ERBB2、KRAS 和BRAF 八 个 基因，另外还包括PD-L1 的表达和TMB 指标。EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、ERBB2、KRAS 和BRAF的突变均有明确靶向药物进行相应治疗，PIK3CA 和NRAS 则与这些靶向药物的耐药相关，因此，作者将这10 个基因纳入了检测范围。目前检测基因突变的方法很多，包括一代sanger 测序、突变阻滞扩增PCR、FISH、高效液相色谱等。之前各国、各地区发表的很多基因突变的调查研究均是基于这些方法，但是这些技术普遍具有通量较小，无法同时进行多基因大通量检测的弊端。随着技术的发展，二代测序法进行肺癌的基因检测已经被写入了各大指南，对指导肺癌靶向用药、研究肺癌的发生发展机制有更大的优势。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取金华市中心医院精准中心2017年1 月至2018 年1 月收治的NSCLC 患者111 例，其中男62 例，女49 例；年龄32～90 岁，平均62 岁。其中腺癌95 例，鳞癌16 例。患者均行肿瘤切除术，手术切除后癌组织经中性甲醛液固定、石蜡包埋后切片，然后经过HE 染色，选取肿瘤细胞占比＞20%的癌组织，进行基因突变检测。

1.2 主要仪器和试剂 实验涉及的主要仪器有NextSeq 500 测序仪（Illumina）、NanoDrop2000（Thermo）、Qubit3.0 荧光定量分析仪（Invitrogen）、4200 核酸分析系统（Agilent）、LightCycler480（Roche）等。实验使用的试剂包括DNA 提取试剂、文库构建试剂、测序试剂。

1.3 基因突变检测方法 （1）DNA 提取：5～10 张FFPE 样 本，采 用DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen）试剂盒提取基因组DNA。提取好的DNA 溶液使用nanodrop2000 进行DNA 浓度及纯度检测，浓度＞3.5ng/µl、1.8 ≤OD260/280 ≤2.1 为合格样本。（2）文库构建及靶向捕获：合格的DNA 样本经核酸打断仪片段化，然后末端修复和加“A”尾，连接后纯化并进行加index 和一轮捕获前扩增使文库＞45ng/µl。然后使用迪安诊断自主研发的杂交捕获探针进行液相杂交，链霉亲和素磁珠进行捕获，捕获后文库进行二次扩增和质量控制，确保主峰大小在200～400bp，Qubit3.0 检测文库浓度＞1.0ng/µl。最后进行文库定量，保证有足够文库用于流动槽上的簇形成后，上机测序。

2 结果

2.1 所有样本检出的基因突变情况 在95 例肺腺癌患者中有84 例腺癌患者（88.42%）检出突变，在16例肺鳞癌患者中有14 例（87.5%）鳞癌患者检出了基因突变，其中EGFR 的突变频率最高，在67 例（60.36%）患者中检出EGFR 突变，其中包括57 例（50%）肺腺癌患者和10 例（62.5%）肺鳞癌患者；其他基因的突变情况分别是KRAS 突变12 例（10.81%），PIK3CA 突变7 例（6.31%），ERBB2 突 变6 例（5.41%），ALK 突 变6 例（5.41%），MET 突变5 例（4.50%），RET 突变5 例（4.50%），ROS1突变3例（2.70%），BRAF突变2例（1.80%），NRAS 突变1 例（0.90%）。本研究中检出的突变形式包括：错义突变（37 种）、无义突变（1 种）、移码突变（1种）、保守性同框缺失（1 种）、保守性同框插入（1 种）、非正码缺失（1 种）、整码插入（4 种）、整码缺失（5 种）、整码插入和缺失（4 种）以及融合（5 种）。

2.2 各基因具体突变形式及人群突变频率 EGFR 的突变形式有28 种，EGFR 的突变集中在18、19、20和21 号外显子上。共有8 例（7.21%）患者在18 号外显子上突变，32 例（28.83%）患者在19 号外显子上突变，在20 和21 号外显子上突变的患者数分别是13例（11.71%）和25 例（22.52%），另外还检测到1 例（0.9%）在4 号外显子上移码突变。其他基因的各种突变形式和人群突变频率具体结果见表1。

表1 111例肺癌患者的具体突变形式统计结果

表1（续）

2.3 共突变的频率和突变形式 在所有病例中，共有17 例患者存在共突变形式，占所有患者的15.32%，其中三突变的患者有4 例，双突变的患者有12 例。三突变患者中，有3 例腺癌和1 例鳞癌。2 例（12.5%）腺癌患者在EGFR 上有3 个不同位点突变，1 例腺癌是EGFR 上2 个基因突变和PI3CA 突变，1 例鳞癌患者为EGFR、MET、KRAS 三个基因突变。13 例双突变患者中，有11 例（11.58%）肺腺癌和2 例（12.5%）肺鳞癌。其中EGFR 单基因双突位点的患者有7 例（全为腺癌），ERBB2 与KRAS 双突的有2 例（腺癌），EGFR 与KRAS（鳞癌）、RET（鳞癌）、ROS1（腺癌）、ALK（腺癌）组合突变的各1 例。具体每位多突变患者的突变检出情况见表2。

表2 17例患者检出多突变情况

表2（续）

3 讨论

肺癌中不同基因在不同人种中突变频率不同。EGFR 是所有10 个基因中研究最多的。据报道，在西方人中NSCLC 患者人群中EGFR 基因的突变率低，约为10%～20%，在亚洲人群中EGFR 的突变率在50%左右［1］，在中国地区，EGFR 的突变率也有较多报道，突变频率在40%～61%［2-3］。较多地区也发表所在地域的EGFR 的突变率，突变频率在32%～58%［4-5］。19 号外显子的插入缺失和20 号外显子上的L585R 是最常见的突变形式。EGFR 上常有多突变的形式出现，双突变出现频率较高为0.47%～2.1%［6-7］，双突变的患者对TKI 类药物的响应低，其中L858R/T790M 是最常见的联合突变。本资料中，发现金华地区的患者EGFR上不仅有8 例双突变，突变频率7.21%，突变频率与以往研究相比略高，而且还发现了三突变形式。这一方面与越来越多的位点被发现相关，还与二代测序的灵敏度更高相关，许多以往在检测下限以下的、检测不出的位点，现在也能更准确的检出。

关于某个特定地区内肺癌基因的突变情况，利用一代或Q-PCR 等方式已发表了很多文章来描述，多数文章的研究只关注1～3 基因，而这些基因集中在KRAS、BRAF、ALK、ROS1、MET 这几个常见基因的组合。如江苏地区肺癌和胃癌患者KRAS 基因突变状态分析只关注单个基因KRAS 的突变情况，经调查发现，江苏128 例肺癌患者中KRAS 突变频率为6.3%［8］。杭州地区89 例肺腺癌患者EGFR、KRAS 与BRAF 基因突变状态分析，只关注了这三个基因在杭州的突变情况调查［9］，Ⅳ期维吾尔族NSCLC 患者EML4-ALK、EGFR 基因突变状态及生存分析，发现97 例新疆维吾尔族肺癌患者中检出6 例（6.2%）ALK 融合［10］，在中国肺癌人群中利用二代测序的检测方式也做了一些探索，但均未能更精细化描述至地区水平。此次研究是首次利用二代测序对金华地区的肺癌患者进行的10个肺癌驱动基因的突变情况描述。

综上所述，利用二代测序技术观察肺癌基因突变情况的全景，有利于短时间内发现更全面的靶药敏感和耐药位点，为患者提供更详细的基因突变信息，对患者疗效预测和治疗方案选择都更有意义。