β-榄香烯对CCI模型大鼠疼痛行为学及背根神经节ERK5蛋白的影响

龚敏操 陈眉 张丽娟

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接造成的疼痛，发病率高，机制不明，且治疗尚无确切有效的方法，对患者造成沉重的经济和心理负担［1-2］。课题组之前实验结果显示，β-榄香烯对于多种疼痛具有明确的干预作用，其机制可能与核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）及炎性介质参与神经病理性疼痛的调控过程有关［3］。据报道，细胞外信号调节蛋白激酶5（extracellular signal-regulated kinases5，ERK5）与NF-κB 等关键转录因子有关，进而共同对疼痛进行调节［4-5］。故作者结合以往的基础，选用慢性坐骨神经挤压损伤（CCI）模型，通过观察大鼠背根神经节ERK5 蛋白表达的变化，来探讨β-榄香烯对NP 干预作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD 大鼠32 只，SPF 级，体质量（220±25.0）g，雌雄各半，饲养期间给予大鼠纯净饮水及标准颗粒饲料，日夜交替12h，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 试药与仪器 β-榄香烯由浙江省中医院脑病研究室提供；盐酸文拉法辛胶囊，惠氏制药有限公司；ERK5 抗体：美国abcam 公司，Ab196609；免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two-Step：丹麦DAKO 公司；意大利UGO BASILE 37450 动态足底触觉仪；日本OLYMPUS CHK 生物显微镜；美国ThermoForma 702 超低温冰箱。

1.3 实验方法 （1）造模与给药：根据Bennettt-Xie［6］建立CCI 模型，用2% 戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，侧卧位固定于手术台上，备皮消毒。右大腿后中部皮肤切开，使用血管钳钝性分离股二头肌和臀肌浅之间的结缔组织，使用拉钩扩大两肌肉之间的距离，清晰坐骨神经。使用弯头眼科镊，缓慢从周围结缔组织中分离近端坐骨神经，约10mm，用4-0外科缝合丝线环绕神经主干分别做4 道轻度结扎环，间距1mm，使神经外膜轻度凹陷，环绕的羊肠线应能在神经上滑动，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应但不影响神经血运，局部敷青霉素粉，缝合肌筋膜及各层组织后缝合皮肤。假手术不做结扎即缝合，只暴露坐骨神经。术毕后将大鼠放入底部铺有软锯屑垫料的塑料盒中，安静温暖避强光环境自由喂养。造模后将大鼠随机分成4 组，并灌胃给药28d，β-榄香烯组予β-榄香烯180mg/（kg·d），文拉法辛组予盐酸文拉法辛25mg/（kg·d），造模组和假手术组予同容积的生理盐水。（2）机械缩足反应阈值（PMWT）检测：各组分别在术前及术后2d、7d、14d、21d、28d进行机械缩足反应阈值检测。开启电源，设定给力最高强度为50g，大鼠放入塑料格中，底部为铁丝网平台，让大鼠自由活动。室内避免强光照射和噪音，适宜温度，老鼠安静后，将探针对准患肢足底中部，避开肉垫。启动按钮，同时计时，探针逐渐加力，老鼠不能耐受抬脚时停止计时，显示的时间为其机械反应阈值。测3 次取平均值，每次间隔5min。清理粪便，继续实验。（3）ERK5 的免疫组织化学：术后28d 取所有大鼠的背根神经节石蜡包埋待用。石蜡切片采用丹麦DAKO公司EnVisionTM 二步法进行测定表，免疫组织化学阳性为黄色或黄棕色，细胞核衬染呈蓝色，结果用显微镜摄像机观察并照相。（4）图像评价方法：采用免疫反应积分（IRS）打分法［7］，即染色强度和阳性细胞百分比的乘积。染色强度可分为4 级：0 级为未见阳性细胞即阴性，1 级弱阳性，2 级中等阳性，3 级强阳性；阳性细胞百分比可分为5 级：0 级为阴性，1 级≤10%，2 级10%～50%，3 级51%～80%，4 级＞80%。乘积分＞3 分才算免疫反应（+）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件包。计量资料以（±s）表示，各组间进行单因素方差分析、SNK 多重比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间PMWT 的比较 实验结果显示，CCI 术前1d 各组PMWT 比较差异无统计学意义（P＞0.05），三组具有可比性。与术前比较，术后2d 各CCI 手术组的PMWT 明显降低（P＜0.01），造模组低值持续至28d（P＜0.05）。与术后2d 比较，β-榄香烯组和文拉法辛组术后14～28d 的PMWT 绝对值明显增加（P＜0.05）；与文拉法辛组术后28d 比较，β-榄香烯组术后28d PMWT 差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠不同时间PMWT的比较［n=8，s，（±s）］

表1 各组大鼠不同时间PMWT的比较［n=8，s，（±s）］

注：与术前比较，*P＜0.01；与术后2d比较，#P＜0.05；与假手术组术后28d比较，▲P＜0.05

组别 术前1d 术后2d 术后7d 术后14d 术后21d 术后28d假手术组 11.97±1.34 11.42±1.98 12.02±2.06 12.39±1.98 12.41±1.52 12.41±1.52造模组 12.34±2.22 5.95±1.36* 5.95±1.26 6.75±1.48 7.08±2.00 7.88±2.00*▲文拉法辛组 13.11±1.45 6.60±1.97* 6.28±1.58 9.07±1.29# 10.11±2.12# 12.11±2.12#β-榄香烯组 12.64±1.98 5.97±1.38* 7.16±1.51 9.23±1.41# 9.89±2.23# 11.89±2.23#

2.2 大鼠背根神经节ERK5 蛋白表达的检测 光镜下观测，模型组的大鼠背根神经节ERK5 阳性细胞表达程度明显增多、增强，胞浆及核内均可见阳性反应，其内充满棕黄色颗粒，与假手术组比较，造模组ERK5 蛋白免疫反应积分明显提高，差异有显著性（P＜0.05）。与模型组比较，β-榄香烯组大鼠背根神经节ERK5 的免疫反应积分降低，差异具有显著性（P＜0.05）。结果见图1～5。

图1 各组大鼠背根神经节ERK5免疫组化积分结果的比较

图2 假手术组

图3 造模组

图4 文拉法辛组图

图5 β-榄香烯组

3 讨论

NP 常与创伤、感染、癌症等多种因素有关，临床表现为自发性疼痛、触诱发痛和痛觉过敏，目前药物治疗有效率不高，迫切需要寻找更为安全有效的新药物。榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的单体，其主要包括β、γ 和δ 三组成分，其中β-榄香烯是最主要的活性成分，β-榄香烯制剂不仅具有良好的抗肿瘤作用，而且作者前期的实验证实β-榄香烯乳剂对于多种疼痛模型具有明显的干预作用［3］。本次实验采用CCI 模型，术后各组大鼠患肢出现足趾并拢、背屈、外翻成防御姿势，行走和休息时不负重，患肢行走无力，运动时明显跛行，足掌悬空、拖行或舔舐等异常行为学表现。β-榄香烯组CCI 大鼠PMWT 绝对值自术后14～28d 后逐渐增加，说明β-榄香烯对机械痛具有明显的干预作用。

背根神经节（dorsaI root gangIion，DRG）位于两节椎骨之间的椎孔内，属于周围神经系统，当外周神经损伤时，DRG 神经元异常兴奋，同时不断向上一级中枢神经元发出冲动，如外周神经损伤或者疾病可导致DRG 神经元减少、神经元之间的连接出现紊乱及创伤性神经瘤的形成等，从而诱导NP 的发生和发展。作为痛觉传入的第一级神经元，在各种伤害刺激性痛觉信息传递和整合过程中发挥着重要作用。何林峰等［8］研究表明DOX 静脉注射可以到达并蓄积于DRG 组织，明显减轻CCI 大鼠的疼痛反应，这一作用与其降低PKCδ 和PKCε 的蛋白表达，诱导DRG 的凋亡有关。本实验结果显示CCI 大鼠DRG 的ERK5 蛋白呈阳性表达，同之前研究一致。

当外周神经损伤时，脊髓水平小胶质细胞的表型、功能发生了改变，活化的小胶质细胞释放多种物质建立起神经元与胶质细胞之间、胶质细胞与胶质细胞之间双向的信息交流通路，从而导致NP 的发生、发展。ERK5 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族的新成员，是小胶质细胞活化的重要胞内信号转导通路，与NP 密切相关。Obata 等［9］发现外周神经损伤后ERK5 在脊髓小胶质细胞激活，且参与了小胶质细胞内痛觉信号的转导过程。另有研究发现CX3CLl/CX3CRl 通过激活脊髓小胶质细胞ERK5，参与NP 发生发展［10］。本试验显示β-榄香烯组大鼠ERK5 的免疫反应积分较造模组明显降低，说明ERK5 蛋白可能在CCI 模型的神经痛症状中起重要作用，且β-榄香烯对CCI 模型大鼠的干预作用可能与抑制ERK5 蛋白的表达有关系。