归芪益母口服液对产后奶牛免疫机能和生产性能的影响

郭启勇，陶金忠，吴心华，郭延生

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

奶牛在围产期经历了妊娠、分娩和泌乳的巨大生理变化[1-3]。奶牛产后对营养元素的需要迅速增高，日粮摄入的营养元素不能满足奶牛产后营养需要，使奶牛发生能量负平衡(negative energy balance,NEB)[1]。NEB导致血糖水平降低，并动员机体提供额外能量，致使血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羟基丁酸(BHBA)浓度升高[2]，B细胞产生的免疫球蛋白减少[3]。高浓度的NEFA与BHBA对血液中性粒细胞功能产生免疫抑制的作用,增加了奶牛对外界病原微生物的易感性[4]。近年来，随着国家减抗、限抗政策的不断升级，开发临床效果好、无毒和无残留的中兽药制剂成为当前兽药研发的热点[5]。归芪益母口服液是在中兽医经典古方归芪益母散的基础上研发的新的中兽药制剂。归芪益母散出自于清代沈莲舫《牛经备要医方》，由黄芪、当归和益母草组成。具有补气生血、活血化瘀之功效，可用于促进同期发情，治疗产科疾病(子宫积液、不孕症、产后瘫痪等)[6]。有研究表明归芪益母散能显著降低围产后期奶牛血液中的白细胞数,增加产后血液红细胞的数量,提高血红蛋白和血小板的含量[7]。目前关于归芪益母口服液对产后奶牛免疫机能和生产性能的研究未见报道，因此本试验以免疫机能和生产性能为评价指标，探讨归芪益母口服液对产后奶牛保健与疾病防治的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和材料FACSEALIBUR流式细胞仪购自美国BD公司；Fossomatic FC 全自动乳体细胞分析仪购自丹麦福斯电器公司 ；IgM、IgG、IgA酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；归芪益母口服液，爱迪森(北京)生物科技有限公司提供，生产批号：130806。

1.2 实验动物分组与处理选择2～4胎次荷斯坦产后奶牛40头，随机分为4组，每组10头，低、中、高剂量组分别灌服归芪益母口服液300，500，800 mL，空白对照组灌服温开水800 mL，连续灌服5 d，用药结束后继续观察7 d。

1.3 外周血T淋巴细胞亚群检测分别于产后0，5，12 d 早晨利用含有肝素的抗凝真空采血管进行颈静脉采血，用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+，操作方法严格按照仪器操作说明进行。

1.4 血清免疫球蛋白检测分别于产后0，5，12 d早晨颈静脉采血，3 000 r/min离心10 min分离血清，用酶联免疫法测定各组奶牛血清IgM、IgG和IgA含量，操作方法按照试剂盒操作说明进行。

1.5 生产性能测定记录各组奶牛用药前、用药后和观察后产奶量，分别于产后0，5，12 d早、中、晚各采集乳样50 mL，按4∶3∶3比例混合后，检测乳成分和体细胞数，操作方法按照全自动乳体细胞分析仪操作说明进行。

1.6 统计学分析试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以x±s表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 归芪益母口服液对产后奶牛血清免疫球蛋白的影响IgA：由表1可见，用药前、用药后与观察后各组之间差异均不显著(P>0.05)，各组用药前、用药后与观察后之间差异均不显著(P>0.05)。

IgM：由表1可见，用药前各组之间差异不显著(P>0.05)，用药后和观察后中、高剂量组之间差异不显著(P>0.05)，但明显高于空白对照组与低剂量组(P<0.05)，空白对照组与低剂量组之间差异不显著(P>0.05)。空白对照组用药后略高于用药前(P>0.05)，其余3组用药后明显高于用药前(P<0.05)；各组观察后略高于用药后，但差异不显著(P<0.05)。表明产后奶牛随时间延长血清IgM略有升高，不同剂量的归芪益母口服液具有一定的促进作用，但以中剂量和高剂量效果最好，但中、高剂量组之间差异不显著。

IgG：由表1可见，用药前各组之间差异不显著(P>0.05)；用药后和观察后中、高剂量组之间差异不显著(P>0.05)，但明显高于空白对照组和低剂量组(P<0.05)，空白对照组与低剂量组之间差异不显著(P>0.05)。各组用药后均明显高于用药前(P<0.05)，其中空白对照组与低剂量组观察后显著高于用药后(P<0.05)，其余2组观察后与用药后组间差异不显著(P>0.05)。表明产后血清IgG含量随康复时间显著升高，中、高剂量归芪益母口服液具有显著促进作用，但两剂量组之间无显著性差异。

表1 不同剂量归芪益母口服液对产后奶牛IgA、IgM、IgG含量的影响(x±s，n=10) g/L

综上，中、高剂量归芪益母口服液可显著提高产后奶牛血清IgM和IgG的含量，但两剂量组之间无明显差异。

2.2 归芪益母口服液对外周血淋巴细胞亚群CD4+、CD8+及其比值的影响CD4+：用药前各组之间差异不显著(P>0.05)；用药后中、高剂量组之间差异不显著(P>0.05)，但明显高于低剂量组(P<0.05)，低剂量组明显高于空白对照组(P<0.05)；观察后空白对照组明显低于其余3组(P<0.05)，其余3组之间差异不显著(P>0.05)。

空白对照组用药后明显低于用药前(P<0.05)，观察后明显低于用药后(P<0.05)；中剂量组用药后与观察后之间差异不显著(P>0.05)，但显著高于用药前(P<0.05)；高剂量组用药后显著高于用药前与观察后，用药前与观察后差异不显著(P>0.05)(表2)。说明产后奶牛随时间延长外周血CD4+含量呈降低趋势，不同剂量归芪益母口服液有增加外周血CD4+含量的作用，以中、高剂量效果最好，但中、高剂量组之间无显著性差异。

CD8+：用药前各组之间差异不显著(P>0.05)；用药后和观察后空白对照组和低剂量组之间差异不显著(P>0.05)，但明显高于中、高剂量组(P<0.05)，中、高剂量组之间差异不显著(P>0.05)(表2)。

空白对照组和低剂量组用药后明显高于用药前(P<0.05)；中、高剂量组用药后与用药前相比差异不显著(P>0.05)(表2)。说明产后奶牛外周血淋巴细胞亚群CD8+含量随恢复时间延长呈上升趋势，中、高剂量归芪益母口服液有减缓外周血淋巴细胞亚群CD8+上升的作用，但两剂量组之间差异不显著。

CD4+/CD8+：用药前各组之间差异不显著(P>0.05)；用药后高剂量组略高于中剂量组(P>0.05)，中剂量组明显高于低剂量组(P>0.05)，低剂量组明显高于空白对照组(P<0.05)(表2)。

空白对照组和低剂量组用药后明显低于用药前(P<0.05)，中、高剂量组用药后略低于用药前(P>0.05)；中、高剂量组观察后均明显低于用药后(P<0.05)，其余2组观察后与用药后之间差异不显著(P>0.05)(表2)。说明产后奶牛外周血淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值随时间延长逐渐呈下降趋势，不同剂量归芪益母口服液具有减缓产后奶牛外周血淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值升高的作用，但以中、高剂量效果最好，但中、高剂量组之间相比差异不显著。

表2 归芪益母口服液对产后奶牛外周血CD4+、CD8+及其比值的影响(x±s，n=10) %

综上，产后奶牛随着时间的延长，外周血淋巴细胞亚群CD4+含量逐渐降低，CD8+含量逐渐升高，以致CD4+/CD8+比值逐渐降低，中、高剂量归芪益母口服液具有显著的拮抗作用，两剂量组相比，拮抗效果差异不显著。

2.3 归芪益母口服液对产后奶牛产奶量和乳成分的影响日产奶量：用药前各组之间差异不显著(P>0.05)；用药后和观察后中、高剂量组之间差异不显著(P>0.05)，但明显高于低剂量组和空白对照组(P<0.05)。各组用药后均显著高于用药前(P<0.05)，观察后均显著高于用药后(P<0.05)(表3)。表明产后奶牛随时间延长，产奶量呈逐渐增高趋势，中、高剂量归芪益母口服液能显著促进产后奶牛产奶量的升高，但中、高剂量组之间相比差异不显著。

乳脂率、蛋白率和乳糖：各组用药前、用药后、观察结束后之间差异均不显著(P>0.05)(表3)。表明产后各试验阶段乳脂率、蛋白率和乳糖无显著变化，归芪益母口服液也对产后奶牛乳脂率、蛋白率和乳糖的变化无影响。

体细胞数：用药前各组差异不显著(P>0.05)；用药后空白对照组明显高于低、中、高剂量组(P<0.05)，低、中、高剂量之间差异不显著(P>0.05)。各组用药后均较用药前明显降低(P<0.05)，观察后均较用药后明显降低(P<0.05)(表3)。表明产后奶牛体细胞数均较高，但随着身体机能的逐渐恢复，体细胞呈降低趋势，不同剂量归芪益母口服液能促进产后奶牛体细胞数的降低，减少患乳房炎的潜在风险，但低、中、高剂量组之间相比差异不显著。

表3 不同剂量归芪益母口服液对产后奶牛生产性能指标的影响(x±s，n=10)

3 讨论

3.1 归芪益母口服液对产后奶牛免疫球蛋白的影响根据最新的研究表明，归芪益母口服液通过黄芪、益母草中的槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、花生四希酸、异鼠李素,当归中的β-谷固醇和豆甾醇发挥作用[8]。槲皮素的分子式C15H10O7，具有一定的抗炎和抗氧化的作用，减轻炎性细胞浸润，改善肝脏代谢[9]。山奈酚具有抗菌消炎、提高免疫力的作用[10]。芒柄花黄素是一种具有类雌二醇分子结构的异黄酮类植物雌激素，通常具有清除自由基、抗癌、促进雌激素分泌，研究表明对前列腺、乳腺、子宫均有促进发育和修复损伤的作用[11]。花生四烯酸是一种长链多不饱和酸，在动物的炎症及免疫反应中起调节作用,在营养物质代谢、白细胞功能调控和血小板激活中也发挥作用[12]，并通过细胞增殖、信号转导和酶反应等方式调控机体稳态[13]。异鼠李素能够促进淋巴细胞增殖[14]，其机制可能与改善细胞内钙离子稳态、线粒体功能、降低Cyt-c和Caspase-9蛋白表达等线粒体凋亡通路相关指标有关[15]。β-谷固醇具有一定的抗炎解热镇痛和促进前列腺素的释放作用[16]。β-谷固醇是一种强抗氧化剂，尤其对脂质氧化的抑制程度很高[17]。

免疫球蛋白是机体抵御外界病原微生物侵入的防线，存在于血液和其他体液中，有特异性识别和结合抗原的能力[18]，是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生的免疫球蛋白[19]，主要分布于血清中。对于维持组织内环境的稳态和体液免疫应答至关重要。这种抗体与自身抗原和入侵的病原体结合，清除凋亡细胞和其他细胞碎片，并引发体液免疫[20]。分泌型IgA主要分布在鼻、咽、气管、肠和膀胱黏膜的表面，是机体黏膜防御系统的主要成分[21]。其能抑制微生物黏膜表面附着，减缓病毒繁殖，对抗外来抗原进入呼吸道或消化道；局部免疫系统遭到刺激后，无需中央免疫系统的参与，直接参与免疫应答[22-23]。奶牛产后处于NEB状态[24]，围产期奶牛内分泌、营养代谢和生理状态的变化，促使奶牛产后免疫力低下[25]，容易受到病原微生物的侵入，加大产后感染性疾病发生的概率[26]。

本试验结果显示，奶牛产后12 d内血清IgA变化不显著，但IgM、IgG逐渐升高，说明奶牛围产期免疫受到抑制[27]，但随着恢复时间延长，免疫能力逐渐恢复[28]，而中、高剂量组归芪益母口服液可显著提高产后奶牛血清IgM和IgG的含量，有助于产后奶牛免疫力的恢复。

3.2 归芪益母口服液对外周血淋巴细胞亚群及其比值的影响CD4+和CD8+的比值是评价机体免疫功能是否平衡的重要指标，当CD4+和CD8+细胞的数量异常或比例失调时，T淋巴细胞调节功能就会失去平衡[29-31]。当发生细菌感染时，效应性T淋巴细胞增多，这与CD8+升高密切相关[31]。对抗细菌感染时，CD8+能够调节免疫应答[32-33]。有研究表明，在正常情况下，牛CD4+/CD8+比值在2.5～4.0[34]。研究显示葡萄球菌感染的奶牛，乳汁中CD8+增高，抑制CD4+的增殖[35]。另有研究指出奶牛围产期发生感染性疾病的原因，与淋巴细胞亚群的改变有关[36]。在本试验中，对照组奶牛外周血CD8+呈上升趋势，说明产后奶牛免疫机能失调，存在不同程度的感染[37-38]，而CD4+与CD4+/CD8+的比值均出现了不同程度的降低，这可能与CD8+活化有关[39-40]。不同剂量组归芪益母口服液均能不同程度提高CD4+的数量，中、高剂量归芪益母口服液能显著提高CD4+的数量。不同剂量组归芪益母口服液组用药后CD8+同对照组一样，出现不同程度的增加，但低剂量归芪益母口服液组增加明显，而中、高剂量组增加不明显，说明中、高剂量归芪益母口服液组奶牛感染病原微生物的几率低于低剂量组。对照组CD4+/CD8+比值随时间延长逐渐呈下降趋势，不同剂量归芪益母口服液具有减缓产后奶牛CD4+/CD8+比值下降的作用，但以中、高剂量效果最好，中、高剂量之间相比差异不显著。综上可见产后奶牛随恢复时间延长，CD4+含量逐渐降低，CD8+含量逐渐升高，以致CD4+/CD8+比值逐渐降低，中、高剂量归芪益母口服液对外周血淋巴细胞亚群具有一定的拮抗作用。

3.3 归芪益母口服液对产后奶牛生产性能的影响奶牛一旦产后发生营养代谢病或乳房炎，产奶量损失可达20%～70%，甚至个别奶牛将会无法泌乳，面临被动淘汰[41]。奶牛生产性能主要包括产奶量、乳成分和体细胞数，对生产性能的测定，可以预测奶牛的健康状况，有效预防牛群疾病的发生[42]。产奶量是衡量奶牛泌乳性能的重要指标[43-44]。本试验在相同的日粮水平和饲养管理水平下，中、高剂量归芪益母口服液组显著提高产奶量。这可能与归芪益母口服液纠正奶牛产后能量负平衡和减少病原微生物感染有关。奶牛在60 d产奶周期内，试验组奶牛产奶量一直高于对照组，说明归芪益母口服液对于延长产奶周期有一定的作用。归芪益母口服液里面的芒柄花黄素和槲皮素均有促进雌激素分泌的作用，产奶量的提高可能与芒柄花黄素和槲皮素的作用有关。

牛奶体细胞数(somatic cell count,SCC) 是指每毫升牛奶中体细胞总数，SCC是反映奶牛健康的一个重要指标，SCC通常是指乳腺脱落的上皮细胞和参与机体免疫的淋巴细胞[45-46]。当乳腺受到外伤或者发生感染时SCC数量就会增加[47]，测定SCC变化有助于及早发现乳房损伤或感染(如乳房炎)，预防和治疗乳房炎[48]。研究发现SCC的变化与产奶量和其他乳成分密切相关，奶牛在患乳房炎时，乳腺细胞受到破坏，导致乳腺分泌机能障碍，SCC升高产奶量减少[49]。本试验结果显示，产后奶牛SCC数量均较高，但随着身体机能的逐渐恢复，SCC呈降低趋势，不同剂量归芪益母口服液能降低产后奶牛的SCC，减少患乳房炎的潜在风险，这与归芪益母口服液能够提高产后奶牛免疫力密切相关。

本试验结果表明，中、高剂量归芪益母口服液能显著提高产后奶牛IgM、IgG、CD4+、CD4+/CD8+含量，降低CD8+含量，显著提高产奶量，降低SCC，减少患乳房炎的潜在风险。