三七治疗阿尔茨海默病的网络药理学分析

孙天赐，李 雯，王登川 （广东省深圳市龙华区中心医院，广东医科大学附属深圳龙华区中心医院，广东深圳 518110）

阿尔茨海默病(AD)是目前老年人死亡的第五大病因[1]，现有研究认为遗传、环境、代谢等多种因素共同作用是其发生的原因[2]。其发病机制包括β淀粉样蛋白的沉积[3]、 tau蛋白异常过度磷酸化[4-5]、胆碱能损伤、兴奋性氨基酸毒性和免疫炎症反应等等[6-8]。然而，除胆碱酯酶抑制剂以及非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂(美金刚)外，仍无公认的临床新型抗阿尔茨海默病药物[2]。近年的研究表明，传统中药三七对阿尔茨海默病具有良好的疗效，但缺乏系统分析和机制的研究。因此，本研究选用网络药理学方法，基于系统生物学的角度研究三七防治AD的作用机理，为三七防治AD提供研究基础，并为进一步实验验证提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 三七所含化学成分的收集与整理

利用BATMAN-TCM(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM, http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)，以SAN QI为检 索词，检索三七的化学成分。

1.2 预测靶标基因

利用BATMAN-TCM，以≥20分、P＜0.05为标准，筛选AD相关靶基因。

1.3 蛋白质互作(PPI)网络的构建及核心基因分析

为探索靶点蛋白之间的相互作用，把三七治疗AD的相关作用靶点上传至STRING(https://stringdb.org/)，以置信度confidence score ＞0.4为参数构建PPI网络图。利用Cytoscape对网络进行拓扑分析，根据“中介中心性”(betweenness)降序排列，筛选核心基因。

1.4 靶点-成分网络构建及分析

根据靶基因和有效成分的预测结果，使用Cytoscape软件将筛选出的有效成分、潜在靶点构建一个药物-靶点网络。在生成的网络中，节点代表化合物、蛋白质，线代表化合物-靶点相互作用。

1.5 GO生物过程与KEGG通路富集分析

将三七治疗AD的相关作用靶点上传至在线KOBAS3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)，分析靶点的GO生物过程与KEGG通路。

2 结果

2.1 三七治疗AD的靶点

三七治疗AD的靶标筛选检索BATMAN-TCM数据库发现三七治疗AD的靶点共14个，与AD的经典通路基本吻合(P＜0.05)，见表1。

2.2 三七治疗AD的靶成分

三七活性成分筛选通过BATMAN-TCM数据库中整理出三七中共75个化合物，手动筛选三七治疗AD的靶点对应的成分共32个，见表2。

2.3 PPI网络的构建及核心基因分析

为了更好地清楚三七治疗AD的作用机制，利用STRING软件构建了三七治疗AD相关靶点的PPI网络，结果见图1。PPI网络中包含14个蛋白质节点，47条相互作用关系(连线)，其中3个蛋白质节点无相互作用关系。利用Cytoscape对网络进行拓扑分析，根据“中介中心性”(betweenness)降序排列，筛选前5位核心基因为乙酰胆碱酯酶(AChE)、α7神经元尼古丁乙酰胆碱受体(CHRNA7)、毒蕈碱型胆碱受体M2(CHRM2)、丝氨酸水酶丁胆碱酯酶(BCHE)、脂蛋白E(APOE)。

2.4 靶点-成分网络构建及分析

使用Cytoscape软件构建在治疗AD方面三七活性成分-作用靶点的网络模型，见图2。从图2中可以看出，32个主要活性成分的14个潜在靶点对比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，充分体现了三七多成分、多靶点的作用机制。其中与靶点相互作用关系最紧密(连线条数为4条)的有Ditertbutyl Phthalate(邻苯二甲酸二叔丁酯)、1,22-Docosanediol(1,22-二十二碳二醇)、(-)-Dicentrine(左旋荷包牡丹碱)、1-Tetradecanol(1-十四醇)、1-Heptadecanol(1-十七烷醇)和N-Nonanol(1-壬醇)。

2.5 GO和KEGG通路分析

进行GO分析，得到的候选靶标具有的功能信息1 586条(P＜0.05)，按P值选取前10条(表3)，结果发现其功能多涉及胆碱能和突触传递、β-淀粉样结合、突触信号传递、跨突触信号传递、顺行跨突触信号、化学性突触传递、铵离子结合、乙酰胆碱结合等方面。以P＜0.05进行筛选，得到30条信号通路(如图3)，其中排名前20的通路分别为胆碱能突触、神经活性配体-受体相互作用、尼古丁成瘾、钙信号通路、化学致癌、AD、肌动蛋白细胞骨架的调节、PI3k-Akt信号通路、癌症、代谢途径、凋亡、色氨酸代谢、药物代谢、内分泌和其他因素调节的钙再吸收、卵巢类固醇生成、脂肪细胞脂解的调节、VEGF信号通路、花生四烯酸代谢、利什曼病、补体与凝血级联。其中胆碱能突触、神经活性配体-受体相互作用两个途径均有5个三七相关的靶基因富集。

表1 三七治疗AD的靶点(≥20分)

表2 三七治疗AD的靶成分

图1 三七治疗AD靶点蛋白的相互作用网络

图2 三七治疗AD的靶点-成分网络关系图

3 讨论

AD是一种慢性的中枢神经系统退行性疾病，是老年期痴呆最常见的一种类型，早期症状表现为短期记忆丧失、失语、方向感下降，病程呈慢性进行性，随着疾病的发展，将严重影响社交、职业与生活功能，直至死亡[9-10]。据世界卫生组织(WHO)估计，全球65岁以上老年人群AD患病率为4%～7%。平均年龄每增加6.1岁，患病率升高1倍，85岁以后患病率可高达20%～30%[3]。数据显示，我国AD患病人数达500万，60岁人群中患病率为5%，80岁为20%[11]。目前关于AD的病因和发病机制尚未完全阐明，也无特效治疗方法可以逆转或阻止AD的病情发展，因此在传统中医药中进行AD的研究，也是解决AD治疗的重要途径。

表3 三七治疗AD的靶基因的GO分析

图3 KEGG数据库通路富集结果

AD在中医学上属于“呆病”范畴，在古代便有明代《景岳全书·癫狂痴呆》和清代陈士铎《石室秘录·呆病》分别以“速扶正气为主”和“治痰即治呆”作为治法及方剂[12]。在20世纪初，“启动于肾虚，进展于痰瘀火，恶化于虚极毒盛”的病机假说和分期辨证施治方案的提出使得AD中医诊疗进一步规范[13-14]。2018年，AD中医诊疗联合共识小组达成的专家共识：AD早期以肾虚为主，应以补肾为原则；中期痰瘀火并现，应化痰、祛瘀、泻火交替或并行；晚期因痰、瘀、火日久而化生毒浊所致，虚极毒盛，形神衰败，需补肾固元，解毒化浊[12]。传统中药如三七、枸杞子、何首乌、巴戟天等有效成分能够通过抗衰老、提高机体免疫、减轻神经元损伤等作用改善老年痴呆动物相关症状[15]。

三七始载于《本草纲目》，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，兼具抗炎、保肝、抗肿瘤、镇痛等作用。药理学研究结果表明，三七具有抗凝血、心血管系统保护、脑组织和神经保护以及肾脏保护等作用[16]。三七的主要活性成分三七总皂苷能显著提高老年大鼠的学习及记忆能力，减少海马神经元凋亡[17]。临床上应用针刺配合三七等药物治疗老年痴呆症，有效改善脑萎缩，对于促进脑组织修复有一定作用[18]。三七皂苷具有改善学习记忆和治疗AD方面的良好作用，作用机制主要涉及调节神经可塑性、调节β淀粉样蛋白Aβ代谢、抗细胞凋亡、抗氧自由基损伤、抗炎症、改善胆碱能神经系统功能等方面[19]。

尽管前期临床实践及实验研究表明，三七对AD具有良好的疗效，但缺乏系统分析和机制的研究。因为中药成分的多样性，加之与人体相互作用的复杂性，进行中药治疗疾病的潜在分子机制比较困难，但系统生物学和生物信息学的发展也为明确中药治疗疾病的机制提供了可能性[20]。网络药理学正是这样一门基于系统生物学和多向药理学，利用生物分子网络分析方法，选取特定节点进行新药设计和靶点分析的药理学分支学科[21-22]。中药治疗疾病往往是通过多条信号通路组成了复杂的信号网络，网络药理学正是以“多基因、多靶点”的特点契合复杂疾病的治疗理念，即通过阐述药物-靶点-基因-疾病之间的复杂网络关系，进行新药研发和药物作用机制研究。系统生物学的研究能直观地揭示药物发挥的网络结构，基于网络药理学的研究为明确中药和中药复方治疗疾病机制提供了可能性[20]。

本研究分析结果显示，三七治疗AD的作用靶点共14个，通过网络进行拓扑分析，前5位核心靶点为ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE。靶点-成分网络构建及分析结果显示，32个主要活性成分的14个潜在靶点对比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶点，亦可作用于不同的靶点，充分体现了三七多成分、多靶点的作用机制。GO分析显示，靶基因主要涉及胆碱能和突触传递、β-淀粉样结合等功能。KEGG通路分析显示，靶基因主要与胆碱能突触、神经活性配体-受体相互作用等通路相关。

通过三七有效成分筛选的5个AD核心靶点也确实在AD的发生发展和治疗过程中发挥重要作用。海马体和大脑皮层区域的乙酰胆碱(ACh)的水平对AD有直接影响，设计和合成广泛的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)来控制ACh大脑的水平是治疗AD的重要策略[23]。CHRNA7基因与多种认知缺陷疾病如精神分裂症、AD有遗传联系[24]。 Chee等[25]的研究表明，CHRM2基因与CHRM3基因中的SNP位点之间相互作用影响是诱发AD的风险。而BChE，像AChE一样，共同调节神经递质乙酰胆碱的代谢，是AD诊断和治疗的靶点[26]。APOE是周围和中枢神经系统的脂质载体，APOE基因的ε4等位基因是晚期AD最强的遗传危险因素[27]。

目前人们通过靶点-成分网络关系分析，筛选出6个与靶点关系最紧密的活性成分：邻苯二甲酸二叔丁酯、1,22-二十二碳二醇、左旋荷包牡丹碱、1-十四醇、1-十七烷醇和1-壬醇，但尚未见与AD相关的文献报道。左旋荷包牡丹碱具有抗实验性心律失常作用[28]，对冠状动脉平滑肌的收缩有显著的拮抗作用[29]， 并能抑制乙酰胆碱酯酶[30]，可能作为三七中起抗AD作用的主要成分之一。三七的主要有效成分三七皂苷多见于AD的治疗研究，在BATMAN-TCM数据库中检索发现其主要作用靶点为ATPA1，不是该系统中AD预测的主要靶基因。三七皂苷有可能通过调节ATPA1进而影响AD相关靶基因的表达，当然这需要进一步的实验验证。

KEGG通路分析结果显示，三七有效成分与AD的靶基因主要与胆碱能突触和神经活性配体-受体相互作用通路相关。胆碱能突触是AD的重要机制已经得到公认[31]，神经活性配体-受体相互作用通路与AD之间的相互作用关系也与文献报道相符[32]。

综上所述，三七治疗AD主要作用于ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE等靶点，并通过胆碱能突触、神经活性配体-受体相互作用等通路发挥作用。本文对活性成分进行分析筛选出6个与靶点最具相关性的成分，为AD的治疗药物分离纯化提供了研究基础。