苦参碱对非小细胞肺癌的放射增敏作用

2020-11-06徐祖敏邓于红贺红桂史华帝左瑜芳广东医科大学附属医院肿瘤中心广东湛江524001

广东医科大学学报 2020年5期

徐祖敏，杨俊，邓于红，贺红桂，史华帝，左瑜芳（广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东湛江 524001）

癌症是全世界面临的公共卫生问题之一[1]，而肺癌患者的死亡率位居所有癌症之首[2]。大多数肺癌在确诊时已为晚期，晚期肺癌5年总生存率＜5%[3]。目前，放疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治疗中具有重要的作用，能够改善肿瘤患者的预后[4]。但是由于放射抵抗，制约了其疗效，亦是造成治疗失败的主要原因之一。因此，寻找新型抗肿瘤药物及低毒高效的肿瘤放射增敏剂，提高放射线对NSCLC的疗效是目前的研究热点。苦参碱(C15H24N2O)属于四环喹嗪啶类生物碱，是传统中药豆科植物苦参分离提纯后的活性成分，有着广泛的生物学活性，如镇痛、控制血脂、抗感染、抗氧化和抗肿瘤等[5]。前期研究表明苦参碱对多种肿瘤具有抗肿瘤作用，包括鼻咽癌、甲状腺癌、乳腺癌、肝细胞癌等[6-11]，但是苦参碱与放射治疗联合对NSCLC细胞的作用尚未见报道。本研究拟在体外实验中探讨苦参碱对NSCLC细胞的毒性作用，以及苦参碱联合放疗对NSCLC细胞放射敏感性的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

人非小细胞肺癌H1299、A549细胞株在37℃、5%CO2饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清(Biological Industries)、1%青霉素(哈药集团)、1%链霉素(哈药集团)的RMPI-1640培养基(Hyclone)进行培养、传代以及开展后续细胞实验。苦参碱购自上海笛柏化学品技术有限公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自碧云天生物公司，Phospho-Histone H2AX抗体购自Cell Signaling Technology，GAPDH 抗体购自碧云天生物公司。

1.2 射线照射

医科达直线加速器，照射前由物理师制定放疗计划并交由技师进行操作。常温下置于直线加速器(医科达，瑞典)4MV X线按放疗计划单的不同剂量进行照射，源皮距(SSD)=100 cm，培养皿底部加1.5 cm厚等效组织补偿膜。

1.3 CCK-8法检测苦参碱对NSCLC细胞作用

取对数生长期的H1299和A549细胞接种于96孔培养板。培养箱培养24 h后，加入含不同药物浓度的培养液(含1%FBS)100 μL/孔，使药物最终质量浓度为0、0.25、0.5、1、2、4、8 g/L，每组药物浓度至少3个复孔，继续培养24、48、72 h后，分别加入含有10% CCK-8的无血清RMPI-1640培养基100 μL/孔，置于细胞培养箱内，孵育2 h后，用酶联免疫检测仪检测450 nm处的OD值。细胞抑制率= 1-(OD加药-OD空白对照) /(OD对照-OD空白对照)×100%。应用Graph Pad Prism 5.0软件计算半数抑制浓度IC50。

1.4 平板克隆形成实验

取对数生长期的H1299和A549细胞制备成单细胞悬液，细胞悬液平均密度为10个/μL，按100、200、400、800和1 600个/孔的密度梯度将细胞接种于6孔板，培养箱孵育24 h，分别设为放疗组和苦参碱联合放疗组。于放疗前24 h加入含0.5 g/L苦参碱的完全培养基(含10% FBS)，24 h后放疗组和苦参碱联合放疗组给予不同剂量照射，剂量分别为0、2、4、6、8 Gy，继续放入培养箱孵育12 h，随后更换新鲜完全培养液。培养箱中继续培养10 d，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，然后固定、染色、计数。存活分数(SF)=受照射细胞的克隆形成率÷对照组细胞克隆形成率×100%，克隆形成率%=克隆数÷接种细胞数×100%。使用Graph Pad Prism 5.0软件，以多靶单击模型y=1-[1-exp(-k×x)]^N拟合细胞存活曲线，并计算放射增敏比(SER)。

1.5 蛋白免疫印迹检测蛋白表达水平

取对数生长期的H1299和A549细胞制备单细胞悬液，按10×104个/皿细胞数接种至6 cm培养皿，分为对照组、苦参碱组、放疗组、苦参碱联合放疗组，培养箱培养24 h后，更换含0.5 g/L苦参碱的完全培养液，培养24 h后以6 Gy剂量进行放疗，细胞放疗24 h后提取细胞总蛋白。定量上样30 μg/泳道，采用10%，15% SDS-PAGE进行电泳，电压为100 V，时间约120 min。将凝胶中蛋白转至PVDF膜上，电流调节为300 mA，90 min。转膜后置于含5% 脱脂奶粉封闭液中，常温下摇床封闭1 h。封闭后，一抗浓度1:1 000，4 ℃冰箱孵育过夜。回收一抗，用新鲜配好的缓冲溶液洗膜3次，每次约10 min，然后用非同一种属二抗浓度1:5 000～1:10 000，室温摇床上孵育1 h，用新鲜配好的TBST洗膜3次，每次约10 min。用辣根过氧化物酶标记的HRP-ECL高灵敏度发光液于暗室中均匀地涂抹于膜的表面，X线胶片曝光，将胶片分别置于显影液、定影液中约5 min，待胶片干燥后扫描胶片。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的H1299和A549细胞制备成单细胞悬液，按10×104个细胞/孔接种于6孔板，分别设为对照组、苦参碱组、放疗组、苦参碱联合放疗组，每组分别设3个复孔。培养箱中培养24 h后，相应的更换含0.5 g/L苦参碱的完全培养液，培养24 h后以6 Gy剂量进行放疗，继续培养24 h后收集各组细胞，用PBS洗涤3次，1 000 r/ min离心5 min，用100 μL的Binding Buffer工作液悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL PI混匀，随后加入400 μL的Binding Buffer工作液，室温，避光，孵育5～15 min，运用流式细胞仪检测凋亡细胞比例，至少重复3次。

1.7 统计学处理

运用SPSS17.0 进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及q检验或Dunnett’s T3检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对NSCLC细胞的影响

在0.25～8 g/L范围内，H1299、A549的细胞存活率随着作用浓度的增加及作用时间的延长而显著降低(P＜0.01)，见图1。

2.2 苦参碱联合放疗对NSCLC放射敏感性的影响

与单纯放疗相比，苦参碱联合放疗能够明显降低H1299和A549细胞克隆数，差异有统计学意义(P＜0.05或0.01)，详见图2。H1299和A549细胞的放射增敏比(SER值)分别是1.22和2.02，二者SER值均＞1，表明苦参碱可增强NSCLC放射敏感性。

2.3 苦参碱联合放疗对NSCLC细胞DNA双链断裂相关蛋白γ-H2AX的影响

苦参碱联合放疗组的γ-H2AX蛋白表达水平较苦参碱组和放疗组显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

2.4 苦参碱联合放疗对NSCLC细胞凋亡的影响

H1299细胞中对照组、苦参碱组、放疗组、苦参碱联合放疗组的细胞凋亡率分别是(5.60±0.60)%、(8.86±1.38)%、 (8.78±3.10)%、 (19.80±1.28)%；A549细胞中对照组、苦参碱组、放疗组、苦参碱联合放疗组的细胞凋亡率分别是(6.32±1.51)%、(14.90±4.29)%、(13.23±3.12)%、(24.55±5.26)%。苦参碱联合放疗组的H1299和A549细胞凋亡率明显高于其他3组(P＜0.01或0.05)。详见图4。

图1 苦参碱对NSCLC细胞的影响

图2 苦参碱联合放疗对NSCLC细胞放射敏感性的影响

图3 苦参碱联合放疗对NSCLC细胞DNA双链断裂相关蛋白γ-H2AX的影响

3 讨论

苦参碱有着广泛的生物学活性，其抗肿瘤的作用越来越受到重视。我们的研究表明，苦参碱可抑制NSCLC细胞的增殖，与前期研究结果一致[12-16]。此外，苦参碱联合放疗组能够显著降低细胞的克隆数，效果优于放疗组和苦参碱组，其在H1299、A549细胞中的放射增敏比分别为1.22和2.02，表明苦参碱可以增加NSCLC细胞的放射敏感性。

在肺癌的治疗过程中超过一半的患者会用到放疗作为治疗的手段。放疗可直接或间接导致肿瘤细胞DNA损伤，从而触发DNA损伤修复信号，招募相关DNA损伤修复因子进行修复[17]。核心组蛋白(H2A)家族，其成员包括H2A1、H2A2、H2AZ、H2AX、H2ABbD、 macroH2AX1和 macroH2AX2。 H2AX作为其中一员，与放疗关系最为密切。当放疗引起DNA双链断裂时，组蛋白H2AX被迅速招募到断裂部位，并磷酸化为γ-H2AX，启动DNA修复。所以γ-H2AX是DNA双链断裂损伤的标志。DNA双链断裂损伤越多形成的γ-H2AX灶点数目也越多[18]。为了进一步阐明苦参碱联合放疗对NSCLC细胞DNA双链断裂以及对γ-H2AX蛋白表达的影响，本研究通过收集不同分组和不同时间点的细胞，检测γ-H2AX蛋白表达的情况，结果发现苦参碱联合放疗组γ-H2AX表达水平较放疗组和苦参碱组显著增加，且放疗后4 h γ-H2AX蛋白的表达较放疗后1 h表达水平高，提示苦参碱联合放疗可增加DNA双链的断裂。

放疗可以直接诱导照射细胞的凋亡或程序性细胞死亡，而且凋亡也是放射治疗诱导细胞死亡的主要机制[19]。无论是苦参碱还是放射治疗，都可以诱导NSCLC细胞的凋亡。为了进一步证实苦参碱联合放疗对肺癌细胞凋亡的影响，我们运用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，结果发现当苦参碱单独作用于NSCLC细胞时能够诱导细胞的凋亡，且当其与放疗联合作用后，NSCLC细胞凋亡更明显，提示苦参碱联合放疗可增强诱导NSCLC细胞的凋亡。