樟树叶木脂素和多酚超声辅助同步提取工艺优化

周海旭 谢美玉高 晗李 波苏同超李忠海

(1. 河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003；2. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

樟树系樟科樟属植物，主要分布于中国的长江流域及南部区域[1]。樟树是中国经济价值较高的、优良的绿化树种，具有四季常青、滞留烟尘、净化空气、美化环境等优点，可用于园林绿化建设[2]。除了作为绿化树种，樟树还是极为珍贵的药用材料和军用工业材料[3]。现代医学研究[1]表明，樟树具有抑菌、杀虫、抗癌等多种功效。根据现有的文献[4-6]报道，樟树中含有多种活性小分子物质。目前学者们[7-8]已经成功从樟树叶中获得多酚类物质和木脂素类物质。其中多酚类物质主要指类黄酮、酚酸、木酚素；木脂素类物质主要是指芝麻素、细辛脂素等。它们具有多种生物活性，例如抗癌、抗氧化和抑菌等[9-11]，但是目前樟树落叶一般归为垃圾处理，不仅污染环境，还造成了资源的浪费[12]。

对于木脂素和多酚的提取方法主要有溶剂提取法、微波辅助技术、超声波辅助技术、超临界技术、亚临界技术。姜少娟等[13]利用超声波辅助技术从香樟叶中提取总黄酮，最优条件下黄酮提取率为42.35%；张峰[14]采用响应面法优化超声波辅助酶解提取樟树去油枝叶中总多酚，最优条件下总多酚提取率均值为22.08 mg/g；袁列江等[15]利用热回流工艺从樟树叶中提取木脂素类物质，最优提取条件下，樟树叶木脂素的提取率最大为(43.39±4.91) mg/g。

目前国内外研究[16-19]主要集中于对樟树叶木脂素和多酚单独的提取方面，未见对两者同步提取的相关研究。研究拟将超声波技术的提取时间短、提取率高的优点应用于同步提取樟树叶中木脂素及多酚类物质，利用超声波技术造成的“空洞”现象[20-22]破坏樟树叶细胞壁，改善木脂素及多酚的选择性从而增加两者的得率。旨在为樟树叶的进一步开发利用提供相关的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟树叶：2018年9月采自中南林业科技大学校内，清洗晒干后粉碎以备用；

无水乙醇、变色酸、浓硫酸、焦性没食子酸：分析级，中国医药集团总公司；

五味子酯甲标准品：质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

电子天平：GR-202型，上海浦春计量仪器有限公司；

摇摆式中药粉碎机：DFY-500型，温岭市大机械有限公司；

循环水式旋转蒸发仪：SHB-Ⅲ型，巩义市予华仪器有限责任公司；

电热恒温水浴锅：HWS26型，上海一恒科学仪器有限公司；

超声波细胞粉碎机：JY92-11型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度仪：UV1800型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 焦性没食子酸标准曲线的绘制 参照文献[23]。

1.2.2 五味子酯甲标准曲线的绘制 参照文献[24]。

1.2.3 多酚及木脂素得率的计算

(1) 多酚得率：按式(1)计算。

(1)

式中：

Y1——多酚得率，mg/g；

m11——多酚粗品中多酚的质量，mg；

m12——样品质量，g。

(2) 木脂素得率：按式(2)计算。

(2)

式中：

Y2——木脂素得率，mg/g；

m21——粗品中木脂素的质量，mg；

m22——样品质量，g。

(3) 总得率：按式(3)计算。

Y=Y1+Y2，

(3)

式中：

Y——总得率，mg/g；

Y1——多酚得率，mg/g；

Y2——木脂素得率，mg/g。

1.2.4 单因素试验设计

(1) 料液比对樟树叶多酚及木脂素得率的影响：准确称取一定质量干燥的樟树叶粉末。以超声波功率300 W，超声时间20 min，乙醇体积分数90%为固定条件，考察料液比(m樟树叶∶V乙醇)分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)时对多酚和木脂素得率的影响。

(2) 超声时间对樟树叶多酚及木脂素得率的影响：准确称取一定质量干燥的樟树叶粉末。分别以超声波功率300 W，乙醇体积分数90%，最优料液比为固定条件，考察超声时间分别为2，3，4，6，8，10 min时对樟树叶多酚和木脂素得率的影响。

(3) 乙醇体积分数对樟树叶多酚及木脂素得率的影响：准确称取一定质量干燥的樟树叶粉末。超声波功率300 W，最优料液比和超声提取时间为固定条件，考察乙醇体积分数分别为50%，60%，70%，80%，90%，100%时对多酚和木脂素得率的影响。

(4) 提取时间对樟树叶多酚及木脂素得率的影响：准确称取一定质量干燥的樟树叶粉末。以超声波功率300 W，最优料液比、超声提取时间和乙醇体积分数为固定条件，考察提取时间分别为40，60，80，100，120 min 时对多酚和木脂素得率的影响。

1.2.5 响应面分析设计 根据单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0.5软件中的中心组合试验设计原理进行响应面试验设计，确定超声波辅助提取樟树叶木脂素、多酚的最佳工艺条件。

1.3 数据统计分析

所有试验均进行3次。试验数据以Excel进行统计分析，并通过Origin 8.0作图；响应面试验通过Design expert 8进行试验设计和数据统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

各因素对樟树叶中木脂素和多酚得率的影响如图1所示。由图1可知，最佳的料液比(m樟树叶∶V乙醇)为1∶20 (g/mL)；最佳的超声时间为4.0 min；最佳的乙醇体积分数为80%；最佳的提取时间为80 min。

2.2 响应面法优化分析

2.2.1 试验因素及水平 根据单因素试验结果，以樟树叶木脂素、多酚的总得率为响应值，分别考察料液比、超声时间、乙醇体积分数、提取时间4个因素对总得率的影响。采用Box-Behnken Design中心组合试验设计原理进行响应面试验，试验因素及水平取值见表1，结果见表2、3。

2.2.2 回归模型的建立及显著性检验 通过Design-Expert 8.0.5软件对表3中的试验结果进行多项拟合回归，得到二次多项回归方程：

Y=44.48+1.52A-1.02B+0.036C-1.60D+1.37AB-0.87AC-3.18AD+1.05BC-0.73BD-2.30CD-2.97A2-4.94B2-5.01C2-3.26D2。

(4)

图1 单因素试验结果

表1 樟树叶木脂素试验设计因素与水平

对所得的回归拟合方程(4)中的变量分别求一阶偏导数，得到一组二元一次方程组，以得到提取樟树叶木脂素、樟树叶多酚的最佳料液比、超声时间、乙醇体积分数和提取时间[26]。在此基础上对方程组进行求解，最终得到提取樟树叶木脂素和多酚总得率的最优条件为料液比(m樟树叶∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超声时间3 min，乙醇体积分数80%，提取时间78 min，在该条件下总得率的理论最大值达到93.14 mg/g。

为了检验试验结果的可靠性和稳定性，在此最优条件下进行5次平行实验分别测定樟叶木脂素得率、多酚得率、总得率。经测定木脂素得率为44.89 mg/g；多酚得率为48.17 mg/g；总得率为93.06 mg/g，相对误差为0.09%。结果表明超声波辅助同步提取樟树叶木脂素和多酚工艺条件可行。

2.3 超声波辅助法与微波辅助法提取效果比较

目前已有研究进行了微波法辅助提取樟树叶中木脂素[16]和多酚类物质[17]，现将其与超声波辅助法进行比较，结果如表4所示。

由表4可知，超声波辅助提取技术比微波辅助提取技术效果好。这是因为两者的作用机理不同：超声波辅助法主要是利用超声的空化效应、热效应以及机械效应来破坏樟树叶的细胞结构进行提取；微波主要利用分子间的氢键断裂和分子间的碰撞以及破坏细胞膜进行提取[27]。

表2 Box-Benhnken试验设方案及结果

表3 木脂素得率的ANOVA分析结果†

图2 各因素间交互作用对总得率影响的曲面图

表4 超声波辅助同步提取和微波辅助提取樟叶木脂素和多酚的比较†

3 结论

研究利用超声波辅助同步提取樟树落叶中的木脂素及多酚，使用响应面法优化及分析，最终确定最佳值为料液比(m樟树叶∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超声时间3 min，乙醇体积分数80%，提取时间78 min，在此条件下木脂素和多酚得率预测值分别为44.89，48.17 mg/g。超声波辅助同步提取樟叶木脂素和多酚法具有提取溶剂少，提取效率高、可以有效降低单个活性的提取成本的特点；同时木脂素、多酚的提取使得樟树叶变费为宝，利于环境的保护，降低环境污染。