敲降Prx V抑制A549肺癌细胞的增殖和迁移

任晨曦，宫伊希，谢丹萍，刘悦，郭晓宇，申贵男，孙虎男

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

在癌症的发生发展过程中，原癌细胞会在原发部位增殖生长，当生长到一定大小后，会侵润周围组织的血管和淋巴，进入血液后，随血液循环转移到其他部位，继续增殖生长形成转移性肿瘤。近年来，肺癌（Lung Cancer）的发病率与致死率居高不下，每年约有超过1 000 000人死亡，人类的生命健康受到严重的威胁[1]。肺癌在发展过程中，癌细胞的高增殖性与易转移性导致肺癌细胞极易发生转移，病情发展较快，患者确诊时已到癌症晚期，导致肺癌患者的存活率极低。依据组织病理学的标准，肺癌可分为两种类型：一种为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），另一种为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。临床上最为常见的肺癌多为非小细胞肺癌，非小细胞肺癌患者约占肺癌患者总数的80%，非小细胞肺癌的快速增殖能力和高转移性是最常见的致死原因[3]。然而传统的手术治疗和化学疗法皆存在着副作用强、治疗经费昂贵等一系列不足，因此，寻找一种可以有效抑制肺癌细胞增殖和转移的新方法迫在眉睫。

过氧化物还原酶（Peroxiredoxins，Prxs）是细胞内的一类过氧化物酶[4-6]，哺乳动物细胞表达六种Prx亚型：PrxI～VI。根据半胱氨酸残基类型不同分为：含有两个半胱氨酸残基的典型Prx I～IV与非典型Prx V和含有一个半胱氨酸残基的Prx VI[7]。在生理条件下，它们负责保护细胞免受DNA氧化损伤和基因组不稳定，调节与H2O2相关的细胞信号，影响细胞的分化和增殖，免疫反应和凋亡[18]。过氧化物酶V（Peroxiredoxin，Prx V）是Prx家族中的一个成员。Prx V在细胞质、线粒体以及过氧化物酶体中广泛存在，能够还原细胞内过氧化氢，烷基氢过氧化物以及过氧亚硝酸盐，清除细胞内的活性氧等[8-9]，对细胞质、线粒体具有抗氧化的保护功能[10]。有研究发现，Prx V在肝癌细胞[11]、结肠癌细胞[12]、胃癌细胞[13-14]凋亡过程中均具有调控作用，过量表达Prx V会通过上调Snail增加胃癌细胞的增殖和侵袭性[15]；在结肠癌细胞内过量表达Prx V会促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，在抑制Prx V后可以有效降低细胞的EMT（Epithelial-to-mesenchymal transition）特性[16]。同时也有研究发现，Prx V的高表达与肿瘤细胞病灶形成、浸润、淋巴结转移、晚期TNM分期有显著的负相关性[17]。但是，Prx V对A549人肺癌细胞的各种生理活性的影响现今并无研究。

研究利用慢病毒载体转染A549人肺癌细胞系，构建Prx V敲降的A549细胞系，对构建的细胞系利用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法进行鉴定，通过MTT实验、细胞划痕实验、群落形成实验及蛋白质印迹法检测两种细胞的增殖、迁移、群落形成能力和相关蛋白表达水平间的差异，初步阐明Prx V对A549肺癌细胞的生理活性的影响，为肺癌的治疗提供新的思路与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

A549细胞系购自大庆市鸿图生物科技有限责任公司（中国，黑龙江）。

1.1.2 试剂及仪器

DMEM/高糖培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自四季青公司；PBS购自HyClone公司；MTT试剂购自Amreso公司；DMSO试剂购自天津市富宇试剂公司；丽春红试剂购自Solarbio公司；0.25%胰蛋白酶购自Solarbio公司；抗mouse anti-Prx V、vimentin、PCNA、P21、抗 rabbit-actin、E-cadherin、Cyclin D1、cleaved-caspase 3的一抗单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；硝酸纤维素膜购自BIO-RAD公司；ECL购自Thermo Scientific公司；细胞培养皿均购于NEST公司；蛋白免疫印迹系统购自美国Amersham Bioscience公司。

1.2 细胞培养

A549肺癌细胞用DMEM/高糖培养基放置于37℃、5%CO2及湿度适宜的培养箱中培养，DMEM/高糖培养基含有10%灭活的新生胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（（penicillin/streptomycin，P/S）。

1.3 Prx V基因敲降的A549细胞的构建

对Prx V的基因序列进行查询，设计针对Prx V基因的 siRNA序列（5′-GGAATCGACGTCTCAAGAGGT-3′）和阴性对照（negative control）siRNA 序列（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），送至苏州吉玛基因公司进行构建和包装，将构建的目的慢病毒载体命名为shPrx V和mock。培养A549肺癌细胞，待细胞汇合率达60%左右，加入相应病毒悬液，每隔12 h进行细胞状态观察，24 h后停止转染。根据转染的病毒将转染后的A549细胞分别命名为shPrx V组和mock组。扩增两组细胞，换用含有2 g·mL-1嘌呤霉素（Puromycin）、20%FBS和1%P/S的DMEM 高糖培养液对转染后的细胞进行抗性筛选。培养至相同培养条件下未转染细胞全部悬浮时，筛选结束，检测细胞转染情况。

1.4 荧光显微镜检测细胞转染情况

将未转染con组A549细胞、转染空载体mock组A549细胞以及转染目的基因shPrx V组A549细胞分别接种于6孔板中，待细胞生长稳定后，去掉6孔板培养皿中原有的液体，PBS溶液清洗2遍，在培养箱中培养10 min，在荧光显微镜下观察明视野及绿色荧光条件下的视野，拍照成像。每组实验均做3次重复。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力

在96孔板中接种两组浓度为3×103的A549细胞。细胞贴壁后，加入10 L MTT溶液，敲打混匀，培养箱中孵育2 h，弃去培养液，加入100 L DMSO（二甲基亚砜）敲打混匀，溶解10 min，利用酶标仪在490 nm测定吸光度（OD）的值。连续检测7 d，绘制两组A549细胞的生长曲线。每组实验均做3次重复。

1.6 划痕试验检测细胞迁移能力

将两组A549细胞以2×105个细胞每孔均匀的接种到24孔板内，过夜培养。待细胞贴壁后，每孔用灭菌的白枪头垂直划线，PBS洗2～3次。用无血清的培养液培养，利用荧光显微镜分别在0、24 h固定位置拍照。每组实验均做3次重复。

1.7 群落形成实验检测细胞群落形成能力

将两组A549细胞以5×103个细胞每孔接种到6孔板内，培养至肉眼可见密集的细胞群落后弃去培养液。3.7%多聚甲醛固定10 min，弃去3.7%多聚甲醛，PBS洗一遍，甲醛溶液固定10 min，弃去甲醛溶液，PBS洗一遍，结晶紫染色40 min，PBS洗两遍，晾干，扫描成像。每组实验均做3次重复。

1.8 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达量

收取成功转染的两组A549细胞，PBS洗一遍，8 000 rpm离心3 min，弃净上清液，冰上操作，加入适量细胞裂解液，每隔5 min敲打一次，共敲打5次。4℃，12 000 rpm离心30 min，取上清液，通过分光光度计测得两组样品在595 nm处蛋白质浓度。配制为20μg/15μL的蛋白质试样，沸水煮样5 min，取15μL进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，转膜，5%脱脂乳封闭 1 h，用含有 10 mmol·L-1的 Tris-HCL（TBS）、15 mmol·L-1的NaCl、0.2%Tween-20 的 TBST 洗涤 5 次，5 min·洗一次，抗 mouseanti-Prx V、vimentin、PCNA、P21、抗rabbitactin、E-cadherin、Cyclin D1、cleaved-caspase 3 单克隆一抗，以1∶2 000进行稀释，4℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗涤5次，5 min。洗1次，5%脱脂乳封闭10 min，与 HRP 标记的鼠或兔二抗（1∶5 000）孵育 1 h，洗膜30 min，5 min更换一次TBST，ECL底物作用。用蛋白质免疫系统进行曝光、显影、定影及结果分析。每组实验均做3次重复。

1.9 统计学分析

以均值±标准差来表示所有的实验结果，t检验检测两组间比较，*P＜0.05表明差异有统计学意义。每组实验均做3次重复。

2 结果

2.1 Prx V在肺癌中的表达差异

为了探究Prx V与肺癌存在的关系，通过http：//gepia.cancer-pku.cn网站对The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的肺癌患者肿瘤组织与正常人肺组织中的Prx V表达量检索结果显示，肺癌患者肿瘤组织中的Prx V表达量高于正常组织；同时Prx V高表达的肺癌患者生存比率明显低于Prx V低表达的肺癌患者（图1A和图1B），但肺癌发展不同时期Prx V表达含量无明显差异（图1C）。这些结果表明，在肺癌发生、诊断以及治疗中Prx V可能会发挥重要的临床意义。

2.2 Prx V基因敲降A549细胞的构建及其对A549细胞增殖能力的影响

为了检测Prx V对A549肺癌细胞的影响，通过荧光显微镜的明视野与绿色荧光视野观察，结果显示细胞已成功转染了慢病毒载体（图2A）。同时蛋白免疫印迹也进一步证明了shPrx V组Prx V蛋白表达水平明显下降，并与mock组具有显著性差异（图2B和图2C）。通过MTT法检测并绘制两种细胞的生长曲线，结果显示shPrx V组细胞的增殖能力显著低于mock组（图2D）。初步研究发现敲降Prx V显著降低A549细胞的增殖能力，因此为了进一步检测Prx V对A549细胞的其他生理活性是否有影响，我们接着进行了划痕和群落形成实验的研究。

图1 Prx V在肺癌肿瘤中的表达和患者预后存活率的数据分析Fig.1 The Prx V expression levels and survival rate analysis in lung cancer patient

图2 敲降Prx V后对A549细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect of Prx V knockdown on the proliferation of A549 cells

2.3 敲降Prx V对A549迁移和群落形成能力的影响

为了检测敲降Prx V对A549细胞迁移能力的影响，通过划痕实验检测发现，与mock组细胞相比，shPrx V组细胞的迁移能力明显被抑制（图3A和图3B）。同时，群落形成实验证明，Prx V基因敲降后，A549细胞的群落形成能力明显下降（图3C和图3D）。为了更进一步验证上述实验结果的准确性，我们利用蛋白免疫印迹实验进行更深一步的研究。

图3 敲降Prx V后对A549细胞迁移和群落形成能力的影响Fig.3 Effect of Prx V knockdown on the migration ability and plate cloning ability of A549 cells

2.4 敲降Prx V对A549增殖和迁移相关蛋白水平的影响

为了明确Prx V对A549细胞的调控作用。通过蛋白免疫印迹法检测两组细胞增殖、迁移和群落形成相关蛋白水平的变化。结果显示：shPrx V组A549细胞中的增殖相关蛋白PCNA表达量明显低于mock组A549细胞；与mock组相比，波形蛋白Vimentin表达量下降、E-caderin表达量升高；细胞周期相关蛋白 P21、Cyclin D1表达量上升；凋亡相关蛋白cleaved-Capase 3表达量增加（图4A和图4B）。以上结果说明，Prx V基因敲降后A549细胞发生G1期阻滞，细胞发生凋亡，进而抑制A549细胞增殖。敲降Prx V也通过改变迁移相关蛋白的表达抑制A549细胞迁移。同时证明了上述MTT实验、划痕实验和群落形成实验的准确性。

图4 敲降Prx V后A549细胞中增殖、迁移相关蛋白的表达情况Fig.4 Expression of markers associated with migration and proliferation in A549 cells after knockdown of Prx V

3 讨论

在2018年，大约有170多万名患者死于肺癌[22]，肺癌对人类幸福生活产生了严重的威胁。由于肺癌患病初期无明显症状，转移到其他部位后，患者感觉不适才会被发现。当发生增殖转移从而扩散后，患者存活的时间仅有几年或几个月。其中非小细胞肺癌最初对化疗和放疗均有耐受性[23]，并且化疗和放疗都具有强烈的毒性反应，导致非小细胞肺癌患者的存活时间被极大缩短，因此找寻抑制肺癌细胞增殖和转移，减缓肺癌患者病情的发展，延长肺癌患者存活时间的新方案迫在眉睫。

有研究证明，Prx V是一种多功能蛋白，在卵巢癌中Prx V是阴性生存预测因子[18]。在CRC结肠癌细胞中Prx V可以调控两种标志性的EMT蛋白Ecadherin和Vimentin的表达，以及EMT相关转录因子Snail和Slug的表达，显著促进了CRC结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。β-拉帕醌能够下调SW480结肠癌细胞中Prx V的表达水平，使细胞内ROS水平升高，并通过线粒体依赖性凋亡途径，诱导细胞凋亡[12]。Prx V可能通过上调Snail的表达，增强间充质表型而导致胃癌预后不良[15]。以线粒体膜间隙为靶点的Prx V能减弱缺氧诱导的活性氧信号[19]。SY5Y神经母细胞瘤细胞中MPP+线粒体凋亡通路是由线粒体Prx V调控的[20]。在肺癌细胞U1810中，Prx V通过影响线粒体凋亡通路、线粒体跨膜电位、钙负荷能力以及线粒体形态对抗抗癌药物诱导的细胞凋亡[21]。Prx V参与了促进胃癌细胞EMT和致瘤表型的多功能机制。此外，Prx V是可能导致预后不良的重要诊断因素。最后，对于各种过表达Prx V的癌症，Prx V是一个公认的治疗靶点和临床策略[15]。

研究中，利用shPrx V组与mock组A549细胞进行对比，发现shPrx V组细胞增殖、迁移和群落形成能力明显低于mock组，结果显示Prx V对A549肺癌细胞的生理活动有着显著的影响。为了进行更深一步的研究，经查阅论文发现增殖性细胞核抗原（PCNA）是DNA复制过程中的一种辅助蛋白。PCNA与DNA复制密切相关，癌细胞增殖能力强，导致患者癌组织内的PCNA蛋白水平较正常组织多[24]。E-钙黏蛋白（E-caderin）的表达促进同种细胞之间连接和黏附，使癌细胞不易从原发灶脱离，能抑制肿瘤细胞的转移。E-caderin表达量减少时细胞迁移和侵袭能力增加[26]。波形蛋白（Vimentin）主要表达于上皮组织和基底膜组织中，与上皮细胞形态以及细胞间紧密连接密切相关[27]。P21与细胞周期蛋白Cyclin D1等密切相关，能调节细胞周期，当P21被激活时则可促进凋亡因子的表达，从而诱导细胞凋亡[25]。因此，利用蛋白质印迹法检测两组细胞增殖、迁移等相关蛋白水平的变化情况发现，与mock组相比，shPrx V组A549细胞中的增殖相关蛋白PCNA表达量下降；迁移相关蛋白Vimentin表达量下降、E-caderin表达量升高；细胞周期相关蛋白P21、Cyclin D1表达量升高；细胞凋亡相关蛋白cleaved-Capase 3表达量增加。以上研究结果表明，敲降Prx V可以有效抑制A549细胞的增殖、迁移和群落形成能力，导致细胞周期阻滞，细胞凋亡。这一研究结果表明了Prx V对调控A549肺癌细胞增殖和迁移能力的重要性。但Prx V对A549细胞增值、迁移过程中所参与的具体信号通路并没有明确的阐明，这将成为我们后续的研究重点。

综上所述，敲降Prx V能有效抑制A549细胞的增殖、迁移以及群落形成能力，同时引起细胞周期阻滞，发生细胞凋亡。这一研究结果为临床抑制肺癌细胞增殖、转移，延长患者存活时间提供了新的治疗方案。