电压门控钙离子通道阻断剂硝苯地平体外杀伤日本血吸虫成虫作用研究

王小莉，杨浩宇，邱 禹，崔 洁，阮立慧，李 亮*

(1.蚌埠医学院 病原生物学教研室 安徽省感染与免疫重点实验室，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠医学院 显微形态实验中心，安徽 蚌埠 233030；3.蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030)

血吸虫病(schistosomiasis)是一种严重危害健康的人兽共患寄生虫病，感染人数达3.95-5.97亿，超过7亿人(多数为儿童)的健康受到该病威胁[1-2]。我国流行的是日本血吸虫病，经过70多年的努力，截至2019年底，全国晚期血吸虫病人30 170例[3]。目前药物化疗仍是我国防控血吸虫病的主要手段[4]，因出色的疗效、广谱的适用性、毒性低等优点，吡喹酮(praziquantel，PZQ)被WHO推荐为抗血吸虫病的首选药物[5]。虽然PZQ对各种类型血吸虫成虫阶段均有良好的杀伤效果，但对童虫阶段作用弱[6-7]。此外，随着长期大范围的使用，PZQ治疗不敏感以及在实验室通过亚致死剂量诱导出耐药性虫体屡见报道[8-10]，因此寻找替代或候选药物治疗血吸虫病亟待解决。

血吸虫细胞内钙离子平衡由多种组分共同调控，如电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)、配体门控钙通道、第二信使门控钙通道、钙释放通道等[11-13]。而一些钙离子通道拮抗剂被证实具有抗血吸虫活性[14-15]。根据PZQ作用后血吸虫有痉挛性麻痹、皮层损伤等现象，多项研究认为PZQ杀伤作用与干扰虫体内钙离子稳态相关[16]，借助RNA干扰技术，进一步揭示VGCC可能是PZQ的作用靶点[17]。既往报道显示VGCC阻断剂硝苯地平对曼氏血吸虫[18]、艾美耳球虫[19]具有抑制作用，但对于日本血吸虫具有何种作用尚不清楚。因此，本研究拟利用VGCC阻断剂硝苯地平，观察其体外对日本血吸虫杀伤作用；通过硝苯地平和PZQ联合，观察硝苯地平对PZQ杀伤日本血吸虫作用的影响，同时利用扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)观察虫体超微变化，进一步探讨硝苯地平杀伤日本血吸虫的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物和虫株

BALB/c小鼠，雌性，18-25 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司[SCXK(京)2016-0010]，(22±2)℃常温环境饲养。阳性钉螺来自中国CDC寄生虫病预防控制所，虫株为中国大陆株。

1.1.2主要试剂与仪器

PZQ片剂(沈阳红旗制药有限公司)。

硝苯地平(Sigma公司)；青霉素-链霉素溶液(碧云天生物有限公司)；DMEM培养液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；二甲基亚砜(Fluka公司)；叔丁醇、戊二醛、氯化钠、二水合柠檬酸三钠(麦克林生化科技有限公司)；

扫描电镜S4700(Hitachi公司)；倒置显微镜(MZ 12.5，Leica公司)。

PZQ片剂、硝苯地平均溶于DMSO中配制成工作液。

1.2 方法

1.2.1动物模型

按常规钉螺逸尾蚴方法获得日本血吸虫尾蚴。挑取尾蚴滴于盖玻片，贴于小鼠湿润的腹部皮肤，尾蚴可经皮侵入小鼠体内。每只小鼠感染60条尾蚴。

1.2.2成虫收集

感染28 d后，采用肝门静脉灌注法，柠檬酸钠生理盐水液体(0.85%氯化钠-1.5%二水合柠檬酸三钠)灌注，虫体随液体冲至80孔/25.4 mm不锈钢筛网，DMEM培养基冲洗滤网，收集液体。根据活力评分标准[19-20]，于倒置显微镜下挑取活力正常的雄虫，每5条/孔虫体培养于6孔板，加入3 mL 完全DMEM(含10%胎牛血清-1%青霉素/链霉素溶液)共培养。

1.2.3硝苯地平对日本血吸虫雄虫的杀伤作用

加入硝苯地平，使其终浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL和1.0 μg/mL，设阴性对照组(加0.1% DMSO)，每组5个复孔。空白组(不加任何药物)作为整个实验监控。加药后置37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育24 h，换液，加入完全DMEM培养基继续培养至96 h，于倒置显微镜下观察虫体活力情况。参照文献[21]，依据虫体运动度、透明度、颜色等，活力评分标准为0-3分，3分：虫体呈透明状、运动活波、体态柔和；2分：虫体呈半透明状、活动差、体态稍僵硬；1分：虫体部分呈不透明，仅头部或尾部轻微活动、体态僵硬；0分：整个虫体收缩呈白色，连续观察30 s没有运动，定义为“死亡”。统计每组虫体活力总分值，计算每组虫体活力平均值为Σ(每组虫体活力总分值) /每组虫体数。

1.2.4硝苯地平与PZQ联合对雄虫的杀伤作用

设4组，分别为A组(加0.1%DMSO)、B组(14 μmol/L PZQ)、C组(1.0 μg/mL硝苯地平)、D组(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)，每组5个复孔。D组先加入硝苯地平，孵育2 h后再加入PZQ。置37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育24 h，换液，加入完全DMEM培养基继续培养至96 h，镜检虫体活力情况。

虫体活力判断标准及统计同上。观察结束，各实验组虫体拍照，记录大体形态。

1.2.5扫描电镜观察

培养结束后收集虫体，5%戊二醛固定12 h；经0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，1%饿酸固定液染色1 h，30%-100%叔丁醇梯度脱水。将虫体真空干燥，置于扫描电镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 硝苯地平体外对日本血吸虫雄虫的杀伤作用

不同浓度硝苯地平作用下日本血吸虫雄虫活力值差异有统计学意义(F=76.06，P<0.05)。与对照组虫体活力值(2.96±0.09)比较，0.05、0.10 μg/mL 硝苯地平组虫体活力值降低，为(2.88±0.18)、(2.84±0.17)，差异(均P>0.05)均无统计学意义。当硝苯地平终浓度为0.20、0.50、1.00 μg/mL时，雄虫活力值分别为(2.24±0.17)、(1.68±0.18)和(1.56±0.17)，与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.001)(见图1)。相关性分析表明，在0.05 - 1.00 μg/mL浓度区间，虫体活力值与硝苯地平浓度(r=-0.880，P<0.01)之间呈负相关，即体外培养的日本血吸虫雄虫活力值随着硝苯地平浓度升高而降低。与对照组(加0.1%DMSO)比较，***P<0.001。

图1 硝苯地平体外对日本血吸虫雄虫的杀伤作用

2.2 硝苯地平与PZQ联合对日本血吸虫雄虫的杀伤作用

实验结果显示，硝苯地平、PZQ作用下日本血吸虫雄虫活力值(F=378.16，P<0.01)差异有统计学意义。B、C、D组血吸虫雄虫活力值分别为：(0.20±0.14)、(1.56±0.17)、(1.32±0.11)，与A组(2.96±0.09)比较，差异(均P<0.01)有统计学意义。C、D组虫体活力值明显高于B组，差异有统计学意义(均P<0.01)；D组与C组比较，虫体活力值降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 硝苯地平和PZQ联合体外对日本血吸虫雄虫的杀伤效应

图2中：与对照组比较，**P<0.01。A对照组(加0.1%DMSO)；B组(14 μmol/L PZQ)；C组(1.0 μg/mL硝苯地平)；D组(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

2.3 日本血吸虫雄虫的形态观察

2.3.1大体形态变化

在镜下可见A组雄虫体态柔和，伸缩自如，弯曲自然，呈透明状，借助吸盘吸附在皿底。B组虫体肿胀，吸盘失去吸附能力，呈白色不透明、无伸缩运动，整个虫体弯曲或蜷缩呈逗点状。C组虫体肿胀，吸盘吸附力下降，运动缓慢；呈白色半透明状，尾部向腹部卷曲。D组螺旋状虫体的头部轻微运动，逐渐恢复运动，伸展体部，呈白色半透明状(见图3)。

图3 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸虫雄虫形态

图3中：A组(对照组，0.1% DMSO)；B组(14 μmol/L PZQ)；C组(1.0 μg/mL硝苯地平)；D组(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。标尺为1000 μm。

2.3.2虫体体表超微结构变化

扫描电镜观察可见正常虫体(A组)体表均匀分布海绵状结构，由细胞质突出形成的褶嵴和深陷的凹窝构成，其上分布有隆起圆凸形感受器；B、C、D组虫体体表损伤明显，体表海绵状结构的褶嵴和凹窝排列紊乱、融合、变窄或消失，感受器乳突变形、陷没或破溃，未见皮层剥落及皮下肌层暴露(见图4)。此外，B组虫体皮层褶嵴皱缩而呈裂缝状，因渗出出现水泡或大面积融合呈腐蚀状。C组可见褶嵴与相邻凹窝大面积融合，间插坑状缺损。D组虫体皮层因褶嵴皱缩和水肿交错呈裂缝状，伴有孔状缺损。

图4 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸虫雄虫超微结构

图4中：A组(对照组，0.1% DMSO)；B组(14 μmol/L PZQ)；C组(1.0 μg/mL硝苯地平)；D组(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

3 结论

在血吸虫的多项生理活动中，VGCC是必不可少的参与者，如细胞内钙离子平衡、肌肉收缩、神经递质释放、基因表达等[22]。VGCC是由多个亚基构成的异源多聚体跨膜蛋白复合物，包括形成孔状结构的主要亚基α1和辅助亚基α2、β、δ、γ。在曼氏血吸虫cDNA序列中，其中1个α1亚基(SmCav1)与脊椎动物的高压激活钙离子通道(high voltage-activated，HVA)L-型的α1亚基相似达50%-55%[23]。硝苯地平是一种高效的L型VGCC拮抗剂，可通过变构结合在α1孔区结构域的不同位置来调节通道[24]。基于硝苯地平活性、血吸虫与脊椎动物VGCC的相似性，因此本研究以硝苯地平作为VGCC拮抗剂。结果显示随着硝苯地平浓度升高(≥0.20 μg/mL)，雄虫活力值明显低于对照组，以1.0 μg/mL硝苯地平作用下虫体活力值最低，表明一定浓度的硝苯地平体外对日本血吸虫雄虫具有杀伤作用。这与Silva-Moraes等采用硝苯地平可杀伤曼氏血吸虫童虫和成虫的研究结果[18]可以相互印证。结合镜下观察1.0 μg/mL硝苯地平组虫体痉挛、卷曲现象，考虑因硝苯地平阻断了虫体VGCC，消除了细胞外钙离子内流，使细胞内钙离子存储释放被耗尽而致虫体活动能力下降或死亡。

日本血吸虫体最外层结构为体壁，体壁皮层具有重要的保护作用，皮层结构的不完整可使虫体因渗透压力、营养物质交换等失衡而死亡，因而皮层变化也往往被用来评估药物的抗血吸虫活性[25-26]。研究证实PZQ的敏感位点是在血吸虫的皮层和肌纤维膜，在本研究的超微变化中PZQ作用后虫体皮层损伤明显，与既往报道相一致[17]。硝苯地平作用后虫体可见皮层的海绵状结构紊乱、融合、缺损，这些变化表明虫体细胞膜对硝苯地平敏感，皮层的损伤会破坏虫体的防御系统，表面暴露的抗原使其容易被宿主的免疫系统识别而被杀伤[27]。经过硝苯地平预孵育后PZQ作用下虫体活力值虽有所恢复，但虫体皮层结构仍可见损伤变化，提示了硝苯地平和PZQ 致皮层的损伤效应并非药物直接作用，可能是诱导虫体细胞内钙稳态失衡导致虫体痉挛性收缩的继发效应，而VGCC参与了这种继发效应，因而PZQ杀伤血吸虫作用可被VGCC阻断剂硝苯地平所拮抗。

世界范围内PZQ 频繁使用诱导血吸虫产生抗药性的问题已引起了广泛关注，而PZQ杀伤作用机制的不明确限制了PZQ衍生物类新药的研发。研究显示多种基于药效基团设计新药或针对高通量筛选出的靶点药物尚无法比拟PZQ杀伤效果[28-30]，因此，寻找抗血吸虫候选药物或新靶点仍道路漫长。本研究表明硝苯地平在体外对日本血吸虫成虫具有一定杀伤作用，其与PZQ联合用药可降低PZQ杀伤日本血吸虫效果，证实了VGCC参与了PZQ抗血吸虫作用，支持了发展VGCC作为抗血吸虫药物靶点的潜在前景[31]。如何通过调整体内用药剂量、时间、病程阶段等给药方案，在利用硝苯地平提高杀虫效果的同时，降低其对PZQ的抑制影响，将是应用钙离子通道阻断剂治疗血吸虫病研究的一个重要问题，有待于进一步探索。