HPLC波长切换法同时测定黄金连清解片中有效主成分的含量

祝 芳,陈 顺

(1解放军总医院第四医学中心药剂药理科,北京 100048;2长征医院药材科)

黄金连清解片是由黄芩、黄连、黄柏、金银花、连翘等5味中药组成的中药复方制剂,具有清热解毒功效,用于风温热病,发热咳喘,口疮咽肿,热淋泻痢等症。其中黄芩、黄连清热燥湿,泻火解毒;黄柏清热燥湿,泻火除蒸,解毒疗疮;金银花清热解毒,疏散风热;连翘清热解毒,消肿散结,疏散风热,诸药合用发挥清热解毒功效[1]。现标准中并未对其含量进行控制,不能全面反映组方质量,也不符合中成药多成分、多靶点的特点,目前未见多成分含量测定的相关报道[2-6]。因此,本试验建立HPLC波长切换法同时测黄金连清解片中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量,对复方中全部5味组方药材进行质量控制,以便为药品的质量标准的提高提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(四元泵,VWD检测器,自动进样器,ChemStation化学工作站);Mettler AE240型电子天平;KQ3200DB型数控超声波清洗器。

对照品:黄芩苷(批号110715-201318;纯度93.3%)、绿原酸(批号110753-201415;纯度96.2%)、连翘苷(批号110821-201615;纯度94.9%)、盐酸巴马汀(批号110732-201611;纯度86.8%)、盐酸小檗碱(批号110713-201613;纯度86.8%)均购自中国食品药品检定研究院;黄金连清解片(长征医院药材科;批号:190408、190422、190520);乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液配制 精密称取黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成1.785 mg/ml黄芩苷对照品储备液,0.944 mg/ml绿原酸对照品储备液,0.519 mg/ml连翘苷对照品储备液,0.381 mg/ml盐酸巴马汀对照品储备液,1.241 mg/ml盐酸小檗碱对照品储备液;精密量取各对照品储备液适量,加甲醇制成含黄芩苷142.80 μg/ml、绿原酸37.77 μg/ml、连翘苷31.13 μg/ml、盐酸巴马汀15.24 μg/ml、盐酸小檗碱74.46 μg/ml的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液配制 取本品10片,研细,取约0.1 g,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入甲醇25 ml,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,滤过,取续滤液,即得。

2.1.3 阴性对照溶液制备 按处方比例和制备工艺分别配制缺黄芩、金银花、连翘、黄连和黄柏的阴性样品,按照“2.1.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0-7 min,5%-15% A;7-25 min,15%-23% A;25-30 min,23%-28% A);流速1.0 ml/min;检测波长:0-10 min,327 nm;10-20 min,280 nm;20-25 min,277 nm;25-30 min,345 nm,柱温30 ℃;进样量10 μl;理论塔板数按黄芩苷计算不应少于3 000[7]。

2.3 专属性考察

分别取混合对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液进样,按“2.2”项下色谱条件进样,黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱与其他峰分离度均大于1.5,峰形较佳,各成分理论塔板数均不低于3 000,色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1,2,5,10,15,20 μl,按“2.2”项下色谱条件进样,记录色谱峰的峰面积。以对照品的进样量(μg)为横坐标,相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,回归方程、线性范围以及相关系数见表1。

2.5 精密度考察

精密吸取混合对照品溶液,按“2.2”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积,计算黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱色谱峰峰面积的RSD分别为0.87%,0.56%,0.83%,1.01%,0.95%(n=6),结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性考察

取同一批号样品(批号:190408),按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份,按照“2.2”项下色谱条件测定,测得黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量的平均值分别为36.28 mg/g,9.680 mg/g,8.173 mg/g,3.928 mg/g,18.37 mg/g,RSD分别为1.37%,0.56%,1.52%,1.71%,0.49%(n=6),结果表明此方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

取供试品溶液(批号:190408),按“2.2”项下色谱条件,分别在0,1,2,4,8,12 h进样,测定黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱色谱峰峰面积,峰面积的RSD分别为0.95%,0.45%,1.52%,1.24%,1.23%(n=6),表明供试品溶液在12 h内稳定。

1.绿原酸(chlorogenic acid);2.黄芩苷(baicalin);3.连翘苷(phillyrin);4.盐酸巴马汀(palmatine hydrochloride);5.盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)图1 混合对照品、供试品、金银花阴性样品、黄芩阴性样品、连翘阴性样品、黄连和黄柏阴性样品的色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances, sample, negative sample without Honeysuckle, negative sample without Scutellaria, negative sample without Forsythia, negative sample without Coptidis Rhizoma and Phellodendri Cortex

表1 5个成分的回归方程与线性关系

2.8 加样回收率考察

精密称取已知含量的样品(批号:190408)6份,每份约50 mg,置于锥形瓶中,分别加入对照品储备液适量,按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.2”项下色谱条件测定,计算回收率,结果见表2。

表2 5个成分的加样回收率考察结果

2.9 样品含量测定

取3个批号黄金连清解片样品,按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.2”项下色谱条件进样,分别计算黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量,结果见表3。

表3 样品中5个成分的含量测定结果 (mg/g,n=3)

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

试验对一系列不同浓度的甲醇(100%,70%,50%,30%)进行考察,发现采用纯甲醇作为提取溶剂时,各个成分提取效率较高,杂质较少,最终确定采用甲醇作为提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

试验同时测定黄金连清解片中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量,5个成分最大紫外吸收波长各不相同,在同一波长下测定难以得到满意的灵敏度,通常会采用分别测定的方法,但试验繁琐,检测时间较长,成本较高。因此,本试验采用波长切换法,分别在其最大吸收波长下测定,既可保证灵敏度同时可以节约成本,提高效率。参照2015年版《中国药典》(一部)和相关文献报道[7,8],确定黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的检测波长分别为280 nm,327 nm,277 nm,345 nm,345 nm[9-11]。

3.3 流动相的选择

试验采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液,发现采用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时,色谱峰基线较稳,结合上梯度洗脱,各个成分可以得到很好的分离效果、峰形,出峰时间也较短,因此采用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。

通过对5味组方药材黄芩、黄连、黄柏、金银花、连翘的各自指标性成分黄芩苷、绿原酸、连翘苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱进行含量测定,可以完整描述黄金连清解片的质量情况。随着分析技术和方法的不断进步,采用多成分含量同时测定的方法被越来越多地用于中药质量控制,较以往依靠单一成分评价中药复方制剂的做法更为全面和严谨,将成为中药研究的发展方向。