四君子汤不同提取物干预糖尿病肾损伤的实验研究

董征艳,王伊楠,郭宇航,张莉丹,王 科,刘 培,姚隆丹,段秀俊

(山西中医药大学中药药剂学实验室,晋中 030619;*通讯作者,E-mail:dxjzhyxy@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus,DM),中医谓之消渴,是一种由胰岛素分泌不足和/或功能缺陷引起,以高血糖为特征的慢性进展性代谢疾病[1]。随着人们生活水平提高,饮食结构改变,兼之经常紧张焦虑,缺乏锻炼等,DM已成现在常见多发病,目前中国DM患者约有1.14亿,占全世界糖尿病27%左右[2],2018年版《国家基本药物目录》重点聚焦慢性病,DM就位列其中。糖尿病不可怕,可怕的是由于长期高血糖导致的高渗血液引起的各种大血管、微血管受损,进而危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等,产生各种并发症。L悄虿死亡者有一半以上是心脑血管所致,10%是肾病变所致。糖尿病肾病(DN)的发生除了高血糖外,血液流变学异常、足细胞病变、糖基化总产物作用、氧化应激损伤内皮等因素也是导致糖尿病肾病发生发展的重要因素[3]。中医认为糖尿病肾病属本虚标实,本虚主要指脾肺肾三脏亏虚,标实指痰饮水湿集聚,瘀血停滞[4-6]。唐英等[7]认为脾虚与糖尿病肾病的发生有着密切的关系,长期饮食肥甘肉厚,饮食失节损伤脾胃,脾失健运,不能及时消化吸收水谷精微,随尿液排出,从而出现尿浊。

健脾经方四君子汤古来有用之治消渴者,如金元四大家之张元素[8],现在临床也有加减治疗DM的研究报道[9,10]。项目组的前期研究结果表明健脾益气经方四君子汤具有明显的降血糖作用,其对糖尿病所致肾损伤的影响研究未见报道,但从病机看糖尿病肾病的发生与发展与脾虚密切相关。鉴于糖尿病肾病在糖尿病并发症中的常见性及重大危害性,本实验研究了四君子汤对糖尿病肾损伤的干预作用。实验通过考察四君子汤不同提取物对糖尿病大鼠的体征、尿量、肾系数、血清生化指标及病理切片等多个方面的影响,较为全面地评价健脾益气经方四君子汤抗糖尿病肾损伤的作用,以期拓展四君子汤的临床应用范围。

1 材料与方法

1.1 药材与药品

党参(批号180103)、白术(批号181201)、茯苓(批号181201)、甘草(批号181103)均购自山西维康堂中药饮片有限公司,经山西中医大学裴香萍副教授鉴定为正品,均符合2015年版《中国药典》标准。蔗糖(批号20190917)购自天津市光复科技发展有限公司;胆固醇(Lot. No.624J031)购自北京索莱宝生物科技有限公司;牛胆酸钠(Lot No.723E051)购自北京索莱宝生物科技有限公司;盐酸二甲双胍肠溶片(批号71808232)购自河北天成药业股份有限公司;尿蛋白定量试剂盒(批号:20190103)、尿素氮(BUN)试剂盒(脲酶法)(批号2019030)均购自南京建成生物工程研究所;Mouse UCR ELISA KIT(CK-E2053)购自上海研吉生物科技有限公司;组织固定液(Lot No.14J26C68),购自武汉博士德生物公司;链脲佐菌素(STZ)(批号S8050)购于美国Sigma公司,称取STZ,加柠檬酸缓冲液将配制成20 mg/ml,即得STZ溶液;柠檬酸(批号:20180409)、柠檬酸钠(批号:20151020),均购自天津市光复科技发展有限公司,分别称取柠檬酸2.1 g、柠檬酸钠2.94 g置于100 ml容量瓶中加蒸馏水溶解至刻度,用时将两种溶液按一定比例混合,将pH值调节至4.2-4.5[11],即得柠檬酸缓冲溶液;水合氯醛(批号:20180110),购自天津市科密欧化学试剂有限公司,称取10 g水合氯醛置于100 ml容量瓶中加蒸馏水溶解至刻度,即得10%水合氯醛。

1.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠70只,体质量(20±13.5)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,许可证号SCXK(沪)2018-0006。

1.3 实验仪器

DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司),三诺安稳血糖仪(产品注册证编号:201724000323)以及配套试纸购于三诺生物传感股份有限公司,DZF-6020真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),TGL18M型离心机(湖南湘立科学仪器有限公司),HH-2数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司),96孔细胞培养板(海门市晶旷实验器材厂),移液枪(上海盛创医疗器械有限公司台州分公司)。

1.4 溶液的制备

1.4.1 四君子汤(SJZT)水提液 按处方比例(党参 ∶茯苓 ∶白术 ∶甘草=9 ∶9 ∶9 ∶6)称取饮片适量,煎煮两次,第一次加10倍量水,回流提取60 min,第二次加8倍量水,回流提取45 min,合并2次煎液,浓缩,减压干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸馏水溶解,制成每1 ml相当于原生药量0.566 g的溶液,即得。

1.4.2 四君子汤(SJZT)水提醇沉液 将按“1.4.1”项下方法制得的水煎液,浓缩至每1 ml相当于原药材1 g,加乙醇使药液的含醇量达到75%,静置12 h,3 000 r/min离心15 min,取上清液,回收乙醇,浓缩,减压干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸馏水溶解,制成每1 ml相当于原生药量0.566 g的溶液,即得。

1.4.3 四君子汤(SJZT)水提醇沉物 取“1.4.2”项下离心后所得沉淀物,减压干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸馏水溶解,制成每1 ml相当于原生药量0.566 g的溶液,即得。

1.4.4 阳性药液 取盐酸二甲双胍肠溶片,除去肠溶衣,研细,取粉末适量,加蒸馏水溶解,制成0.003 g/ml的溶液,即得。

1.5 造模

SPF级雄性SD大鼠70只,随机选取其中9只作为空白对照组,空白对照组用普通饲料喂养;其余61只大鼠高糖高脂饲料(基础饲料58.5%,胆固醇1%,蛋黄粉10%,蔗糖20%,猪油10%,胆酸钠0.5%)喂养4周。4周后隔夜禁食不禁水12 h,腹腔注射STZ 40 mg/kg(空白组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲溶液),72 h后禁食12 h,断尾取血测空腹血糖,血糖值≥11.1 mmol/L造成糖尿病模型[11]。

1.6 分组与给药

将造模成功的45只大鼠随机分为模型组、阳性药组、四君子汤水提液组、四君子汤水提醇沉物组、四君子汤水提醇沉液组,每组9只大鼠。空白组和模型组大鼠以10 ml/kg灌胃(ig)蒸馏水,其余各组大鼠以10 ml/kg分别灌胃(ig)相应受试药物,每天1次,连续给药28 d。期间空白组以正常饲料喂养,其余各组均继续以高糖高脂饲料喂养。

1.7 观察指标及检测方法

给药期间每日观察大鼠饮食、活动、毛色等基本状况,每周测定体质量。末次给药后,收集大鼠24 h尿液,并采用断尾法取血测定血糖(FBG);之后将大鼠用10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,离心分离血清,分装存放于-80 ℃冰箱。取出肾脏组织,组织固定液固定24 h,HE染色,置光学显微镜(×200)下观察各组大鼠的肾脏组织变化情况,记录肾系数(肾脏重量/大鼠体质量×100%)。取收集到的尿液,按试剂盒检测方法检测24 h尿蛋白(PRO);取冻存的血清,按试剂盒检测方法检测尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。

1.8 统计学处理方法

2 结果

2.1 对大鼠体征的影响

表1可见,模型组的毛色、活动及反应均明显区别于与空白组,但各给药组均可改善由于高血糖导致的大鼠的行为异常。由表2可见,当第4周注射完STZ后,空白组体质量继续上升,其余各组大鼠体质量下降。与空白组比较,模型组大鼠体质量在第5,6周明显下降(P<0.05),在第7,8周显著下降(P<0.01)。与模型组相比,各给药组体质量无显著性差异。不同给药组间比较也无统计学差异。

表1 四君子汤不同提取物对大鼠一般行为学的影响

表2 四君子汤不同提取物对大鼠体质量变化的影响

2.2 对大鼠尿量和肾系数的影响

由表3可见,与空白组比较,模型组大鼠尿量及肾系数显著增加(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组尿量及肾系数显著降低(P<0.01),SJZT水提醇沉物组尿量明显降低(P<0.05)。与阳性药组比较,其余各给药组肾系数明显升高(P<0.05)。

表3 四君子汤不同提取物对大鼠尿量和肾系数的影响

2.3 对大鼠血清生化指标FBG、urine protein、SCr、BUN的影响

由表4可见,与空白组比较,模型组大鼠FBG、SCr、BUN显著升高(P<0.01),尿蛋白明显升高(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组FBG、尿蛋白、SCr、BUN显著降低(P<0.01),SJZT水提液组FBG、尿蛋白、SCr显著降低(P<0.01),BUN明显降低(P<0.05),SJZT水提醇沉物组SCr、BUN明显降低(P<0.05)。与阳性药组比较,SJZT水提液组SCr、BUN显著升高(P<0.01),SJZT水提醇沉物组及SJZT水提醇沉液组各指标均显著升高(P<0.01)。与SJZT水提液组比较,SJZT水提醇沉物组FBG、SCr明显升高(P<0.05),SJZT水提醇沉液组urine protein显著升高(P<0.01),FBG 、SCr明显升高(P<0.05)。

表4 四君子汤不同提取物对大鼠生化指标的影响

2.4 对大鼠肾组织病理切片的影响

与空白组比较,模型组的肾小球基底膜明显增厚,此外没有出现明显的肾小球系膜基质增生、肾小管管腔扩张、肾组织炎性细胞浸润等肾损伤的明显病理改变;与模型组比较,各给药组均明显改善了肾小球基底膜的增厚现象(见图1)。

图1 四君子汤不同提取物干预的糖尿病大鼠肾组织HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of renal tissue in diabetic rats after treated with different extracts of Sijunzi decoction (×200)

3 讨论

3.1 四君子汤不同提取物的选择依据

四君子汤传统是取水煎煮的汤液,实验比较了四君子汤全方水煎液、四君子汤水提醇沉液、四君子汤水提醇沉物各自的抗糖尿病肾损伤作用,其中全方水煎液中含有了大分子与小分子物质,水提醇沉液基本含有小分子物质,醇沉物基本包括大分子物质,实验通过考察四君子汤此3个不同部位的药效作用,可以为以后制剂研究中的工艺设计提供实验依据。

3.2 肾功能评价指标的选择依据

除体征及病理切片外,实验主要选择了4项血清生化指标[空腹血糖(FBG)、蛋白尿(PRO)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)]及尿量与肾系数作为实验主要考察指标。

糖尿病肾病早期会出现肾小球损害,肾小球滤过膜的通透性增加,出现了蛋白尿(PRO)[12];肌酐(SCr)是肌肉中的代谢产物,尿素氮(BUN)是机体蛋白质代谢的最终产物,二者均作为机体代谢废物由肾小球滤过排出体外,如果肾脏损伤,不能将其及时排出,会在体内集聚,使血清中水平升高[13];高血糖可严重损伤微小血管或毛细血管内壁,导致肾毛细血管淤堵,加剧肾脏的负担,加速肾功能衰竭,血糖现在也是肾功能评价指标之一。故本实验选择PRO、SCr、BUN、FBG作为考察指标。

此外尿量可以综合评价肾小球的滤过及肾小管的重吸收功能,而肾系数是衡量肾脏肥大的客观指标,可用来佐证肾脏组织病理改变[14],故实验同时将尿量及肾系数作为实验评价指标。

3.3 基于血清生化指标的实验结果分析

从实验结果看,相较于空白组,模型组FBG、SCr、BUN、PRO均明显升高,差异有统计学意义,说明从生化指标的角度看,糖尿病持续4周可以造成较大程度的肾损伤。相较于模型组,阳性药组FBG、SCr、BUN、PRO均显著降低,差异有统计学意义,说明二甲双胍可以显著改善糖尿病所致的肾损伤;四君子汤水提液组FBG、SCr、BUN、PRO均明显降低,差异有统计学意义,说明四君子汤水提液可以明显改善糖尿病所致的肾损伤,这也为四君子汤临床用于抗糖尿病肾损伤提供了一定的实验依据;四君子汤水提醇沉物组SCr、BUN明显降低(P<0.05),其FBG、PRO及水提醇沉液组四个生化指标均呈现良好的改善趋势,但不具有统计学差异。相较于阳性药组,四君子汤水提液组FBG、PRO有一定程度升高,但不具有统计学差异。实验结果显示四君子汤用于抗糖尿病肾损伤以全方水煎煮为佳,其水溶性大分子物质与小分子物质均具有一定的抗糖尿病肾损伤作用与模型组比较有了统计学差异,这也为该方以后可能的制剂开发提供一定的参考。

3.4 基于体质量、尿量及肾系数的实验结果分析

从实验结果看,模型组相较于空白组,体质量显著降低,差异有统计学意义,与现实生活中的糖尿病患者“三多一少”中的体质量减轻的症状相吻合。体质量减轻有利有弊,可以降低身体负荷,改善胰岛素抵抗,但体质量过度减轻会使人营养不良,免疫力降低。关于糖尿病患者体质量减轻的机制目前尚不明确,为项目可能的后续研究提供一定思路。

模型组相较于空白组,尿量、肾系数显著升高,差异有统计学意义,说明糖尿病大鼠持续4周可以造成较大程度的肾损伤。相较于模型组,阳性药组尿量、肾系数均显著改善,差异有统计学意义,说明二甲双胍可以显著改善糖尿病所致的肾损伤,四君子汤水提醇沉物组尿量明显降低(P<0.05),其他给药组尿量及肾系数均有一定程度降低,但不具有统计学差异。与阳性药组比较,其余各给药组肾系数明显升高(P<0.05),尿量有一定程度升高。但无统计学差异。实验结果显示四君子汤具有一定的干预2型糖尿病肾损伤的作用,其中四君子汤水提液作用更加明显,但就尿量及肾系数而言不及二甲双胍。

3.5 基于肾实质的实验结果分析

糖尿病肾病是糖尿病最主要的并发症之一[15],其主要病变特征为肾小管肥大,基底膜增厚、系膜区细胞外基质积聚以及肾小球、肾小管纤维化等[16-17],进一步发展,会导致肾衰竭,严重影响患者的生活,甚至威胁患者生命。从模型组病理切片的实验结果看,糖尿病大鼠造模成功后,维持高糖高脂喂养4周,除基底膜增厚明显外,其他并未见明显异常,说明从器官实质情况看,实验期间并未对造成明显肾损伤。此外各给药组与模型组比较均明显改善了肾小球基底膜的增厚现象,说明不管是二甲双胍还是四君子汤均具有一定的肾保护作用,而作用机制有待于进一步研究。

3.6 四君子汤抗Ⅱ型糖尿病肾损伤的部位综合分析

四君子汤不同提取物均能够降低血糖,减少尿蛋白排泄,具有一定的干预2型糖尿病肾损伤作用,其中四君子汤水提液改善糖尿病所致的肾损伤作用更明显。提示四君子汤用于抗糖尿病肾损伤以全方水煎煮为佳,其水溶性大分子物质与小分子物质均具有一定的干预糖尿病肾损伤作用。本实验结果可为四君子汤干预糖尿病肾损伤的物质基础研究提供参考,同时也为其干预糖尿病肾损伤的临床调剂用药及制剂研发的工艺原则提供实验依据。

3.7 盐酸二甲双胍与四君子汤的效果比较分析

盐酸二甲双胍作为价格便宜、经济实惠、效果显著的传统一线降糖药,实验结果显示其在干预糖尿病肾损伤方面作用明显,这也为拓宽盐酸二甲双胍的临床应用范围,用于抗糖尿病肾病提供了一定的实验依据。从生化指标的检测结果看,四君子汤水提液组4项指标均明显优于模型组,差异有统计学意义,但不及盐酸二甲双胍组。作为中药复方,毕竟成分复杂,且活性成分的服用量远远不及化学药,虽说从生化指标的角度不及盐酸二甲双胍,但中药具有的配伍作用更利于发挥多靶点、多途径的治疗作用,且毒副作用不明显,所以四君子汤的抗糖尿病肾损伤作用也很值得肯定。