蓝色小麦游离酚和结合酚的综合提取及红外光谱分析

王彩霞 刘富明 郭静雨 徐 瑶 涂媛媛 李 诚

(四川农业大学食品学院1，雅安 625014)(屏山县市场监督管理局2，宜宾 645350)

多酚是一类具有广泛生物活性的植物次生代谢物，其活性包括抗氧化、抑菌、抗癌和保护心血管等[1, 2]。小麦多酚含量丰富，许多学者对普通小麦多酚的提取及活性做过深入研究[3, 4]，而花色苷含量更丰富的彩色小麦却少有研究。蓝色小麦富含花色苷，多酚含量和抗氧化活性高于紫色及普通小麦，是天然多酚的良好来源[5]。

多酚在植物体内的存在形式通常有游离态和结合态两种，目前对植物多酚的提取，绝大多数仅针对游离酚，而以结合形式存在的多酚，因不能直接被有机溶剂萃取，常被忽略，这不仅使所提取的多酚总量低于实际值，也低估了多酚的营养和应用价值。小麦中的酚类绝大多数以结合态形式存在，其结合酚的抗氧化活性高于游离酚[5, 6]。开展蓝色小麦游离酚和结合酚综合提取方法的研究，对于全面评价蓝色小麦多酚的营养价值具有重要意义，也可为蓝色小麦资源的开发和深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝色小麦(蜀蓝麦1701)，四川农业大学农学院提供，粉碎后过100目筛备用；无水乙醇、H2SO4、乙酸乙酯、福林酚：分析纯。

1.2 仪器与设备

Varioskan Flash酶标仪，Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪。

1.3 蓝色小麦多酚提取

1.3.1 基本提取工艺

游离酚的提取参考向莉[7]方法并做适当修改：蓝色小麦粉中加入乙醇溶液，于超声功率240 W条件下提取游离酚，超声提取2次。提取液经真空浓缩、冻干后得到游离酚。

结合酚的提取参考杨希娟等[8]的方法并做适当修改：将提取游离酚后的蓝色小麦残渣收集，加入正己烷(液料比20 mL/g)，振荡3 min，离心，弃上清液。残渣加入H2SO4溶液水浴，冷却后用乙酸乙酯萃取(每次萃取液料比20 mL/g，萃取4次)结合酚。萃取相经真空浓缩，冻干后得到结合酚。

1.3.2 单因素实验

以游离酚提取量为指标，考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10、15、20、25、30 mL/g)、超声时间(5、10、15、20、25 min)和超声温度(40、50、60、70、80 ℃)对游离酚提取效果的影响。

以结合酚提取量为指标，考察H2SO4浓度(5%、10%、15%、20%、25%)、液料比(10、15、20、25、30 mL/g)、水浴时间(30、40、50、60、70 min)和水浴温度(60、65、70、75、80 ℃)对结合酚提取效果的影响。

1.3.3 响应面实验

在单因素实验基础上，选取对提取效果影响较大的三个因素，采用Box-Behnken模型，以游离酚和结合酚提取量为指标，确定最优提取工艺。

1.4 多酚含量测定

福林酚法[9]。

1.5 傅里叶红外光谱分析

参照万山等[10]的方法略改：将样品置于红外光谱仪中测定。扫描分辨率为4 cm-1，扫描波数范围为4 000～450 cm-1，扫描次数为32。

1.6 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS19.0、Design-Expert 8.0对数据进行统计分析及作图。所有实验重复3次，结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素结果

2.1.1 乙醇/H2SO4浓度对蓝色小麦游离酚/结合酚提取效果的影响

乙醇浓度对蓝色小麦游离酚提取的影响如图1所示：蓝色小麦游离酚提取量随乙醇浓度的增大先升高后降低，60%时达到最大，这可能与蓝色小麦中游离酚的极性有关，60%的乙醇溶液和蓝色小麦游离酚的极性更接近，游离酚与乙醇的结合作用强，游离酚溶出量高，而当乙醇浓度高于60%后，提取溶剂极性降低，使得水溶性游离酚的溶解能力下降，进而导致游离酚得率降低。Branimir等[11]利用乙醇从薄荷中提取多酚的研究也认为乙醇浓度是决定游离酚提取效果的重要因素。

结合酚多为多酚与细胞壁物质、多糖类物质结合形成，因此需先经水解使细胞壁等物质与多酚分离后再萃取[12]。本研究采用适当浓度的H2SO4进行水解，H2SO4浓度对蓝色小麦结合酚提取量的影响如图1所示：与游离酚相同，结合酚的提取量随H2SO4浓度的升高先增大后降低，当硫酸浓度为10%时，蓝色小麦结合酚提取量达到最大值。冯悦等[13]在提取紫薯结合酚时也发现类似结果，这可能是因为在5%～10%范围内H2SO4浓度的增加促进了糖苷键的断裂利于结合酚的释放，而 H2SO4浓度超过10%会使释放出来的结合酚被破坏分解，造成结合酚提取量降低。

图1 乙醇/H2SO4浓度对游离/结合酚提取效果的影响

2.1.2 液料比对蓝色小麦游离酚/结合酚提取效果的影响

液料比是影响多酚提取的重要因素，溶剂过少，提取不充分，溶剂过多，不仅增加成本、加大溶剂回收难度，对提取效果也有一定影响。如图2所示，提高液料比，在一定程度上可以提升蓝色小麦游离酚的提取量，但当液料比超过20 mL/g后游离酚的提取量开始下降，分析其原因可能是过多的溶剂增加了提取过程中的热负荷，增大了浓缩能耗，造成了酚类物质的分解。Zoran等[14]的研究也证实液料比过高不利于多酚的提取。

当液料比在10～15 mL/g之间时，蓝色小麦结合酚的得率随液料比加大而升高，而当液料比超过15 mL/g后，结合酚的得率随着液料比的加大开始下降。液料比升高，H2SO4的绝对含量增大，过多的酸不仅能水解糖苷键，也会降解结合酚，造成总酚含量下降[15]。王婧等[16]利用H2SO4水解糖苷键提取结合酚的研究也发现，溶剂比例过高导致结合酚的提取量下降。

图2 液料比对游离/结合酚提取效果的影响

2.1.3 超声/水浴时间对蓝色小麦游离酚/结合酚提取效果的影响

超声波产生的空化效应能形成局部高压，加速细胞壁破裂，提高提取效率[17]。超声波作用于物料的时间对多酚的提取影响较大：超声时间过短，细胞结构破坏较少，酚释放不充分，多酚提取率低；超声时间过长，一方面累积的超声能量可能会破坏多酚的结构，另一方面酚类在空气中暴露时间越长，被氧化的概率越大，造成多酚提取率下降[18]。如图3所示，在5～15 min范围内，延长超声处理时间能有效提升蓝色小麦游离酚的提取量，但超声提取时间超过15 min，游离酚量开始下降，时间越长，下降越多。

60 min之前，随水浴时间延长，结合酚提取量快速增加，这表明水解时间延长有利于糖苷键的断裂，但水解超过60 min，结合酚提取量开始降低。王振宇等[19]也认为水解时间应适宜，过短不能使结合酚与相连的化学键完全断裂，过长会使已释放的结合酚被降解，杂质大量溶出，不利于结合酚提取。

图3 超声/水浴时间对游离/结合酚提取效果的影响

2.1.4 超声/水浴温度对蓝色小麦游离酚/结合酚提取效果的影响

如图4所示，适当提高超声提取温度有利于蓝色小麦游离酚的提取，这是因为适当的高温可以加速酚类物质的扩散速度，使其更易从原料中浸出。本研究中当超声提取温度为50 ℃时游离酚提取量升至最高点，此后继续升温，提取量逐渐降低，这可能是由于温度过高导致酚发生降解或温度过高引起乙醇的大量挥发所致。Teh等[18]也指出尽管升高温度可以提升超声波的空化效应，加速细胞结构的崩解，加快酚类的溶出，但过高的温度也会引起溶剂中多酚的分解。

从图4可看出，在40～75 ℃范围内，增加水浴温度可明显提高结合酚的提取量，但水浴温度不宜超过75 ℃，因为温度过高会引起酚类物质的分解，导致提取量下降，因此在实际操作中选择75 ℃。卢婉容等[20]利用酸法提取木瓜皮中的结合酚，也认为水解温度过高反而会导致提取率下降。

图4 超声/水浴温度对游离/结合酚提取效果的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 模型检验方差分析

对提取蓝色小麦游离酚的乙醇浓度，液料比及超声时间进行进一步响应面优化，提取结果如表1所示，方差分析结果如表2所示。游离酚提取量与各因素间的二元回归方程为：Y=1 065.60+6.13A-1.75B+5.38C-0.50AB+4.25AC+0.000BC-26.43A2-19.68B2-15.42C2。由方差分析可知，游离酚提取的响应面模型极显著，失拟项不显著, 表明该回归模型拟合性能良好，准确性高，可反映优化提取效果。方程一次项A、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2对响应值影响极显著，一次项B影响显著。三个因素对游离酚提取量的影响大小为：乙醇浓度>超声时间>液料比。

将提取蓝色小麦结合酚的液料比、水浴温度和水浴时间采用响应面优化，实验结果如表1所示，方差分析结果见表2。三因素对结合酚提取量影响的二元回归方程为：Y1=1134.00+0.62A1-0.88B1+1.75C1+2.50A1B1+3.25A1C1+0.75B1C1-8.00A12-6.00B12-5.75C12。由方差分析可知，结合酚提取的响应面模型极显著，失拟项P>0.05，拟合良好。方程一次项C1对结合酚提取量影响显著，交互项A1B1、A1C1和所有二次项对结合酚提取量影响极显著。对结合酚提取量的影响，三个因素的排序依次为：水浴时间>水浴温度>料液比。

表1 游离酚/结合酚提取响应面实验设计及结果

表2 游离酚/结合酚提取回归方程方差分析

2.2.2 响应面交互效应分析

如图5a所示，当游离酚提取的料液比取零点值时，乙醇浓度和超声时间两者之间交互作用的等高线为椭圆形，交互作用显著。分别固定超声时间和乙醇浓度，游离酚提取量随乙醇浓度和超声时间增加均先升高后降低，说明控制好乙醇浓度和加超声时间对游离酚的提取至关重要，这与方差分析结果一致。

结合酚提取的响应面交互分析如图5b和图5c所示，料液比和水浴温度，液料比和水浴时间之间交互作用的等高线均为椭圆形，交互作用显著。分别固定水浴温度和液料比，结合酚提取量随液料比和水浴温度增大均先升高后降低；分别固定水浴时间和液料比，结合酚提取量也随液料比和水浴时间提高均先增大后减小。

2.2.3 响应面验证

响应面分析得到游离酚最佳提取参数为：乙醇浓度61.31%、液料比19.68 mL/g、超声时间15.65 min，模型预测的游离酚提取量为(1 057.0±4.3)μg/g。为方便操作，实际设置参数为：乙醇浓度60%、液料比20 mL/g、超声时间15 min，验证实验的游离酚提取量为(1 066.0±2.7) μg/g。验证与预测结果十分接近，说明响应面优选的条件可靠。

图5 各交互作用对游离酚/结合酚提取的响应面图

模型预测得出结合酚提取最优条件是：液料比15.33 mL/g、水浴温度74.78 ℃、水浴时间61.23 min，此条件下预测结合酚提取量可达到(1 128.0±4.7) μg/g。实际调整参数为液料比15 mL/g、水浴温度75 ℃、水浴时间60 min进行验证实验，得到结合酚(1 134.0±5.6) μg/g，与理论预测值接近，说明响应面优选的提取条件可靠。

2.3 傅里叶红外光谱分析结果

图6 蓝色小麦游离/结合酚的傅里叶红外光谱图

3 结论

本研究先对蓝色小麦中的游离酚进行提取，提取工艺为：乙醇浓度60%、液料比20 mL/g、超声功率240 W、超声温度50 ℃、超声时间15 min、提取2次，游离酚提取量为(1 066.0±2.7) μg/g。之后继续从残渣中提取结合酚，提取条件是：H2SO4浓度 10%、液料比15 mL/g、水浴温度 75 ℃、水浴时间 60 min、乙酸乙酯萃取 4 次，结合酚提取量可达(1 134.0±5.6) μg/g。红外光谱分析证实提取的游离酚和结合酚样品中含有多酚类化合物的典型基团。与传统仅用有机溶剂提取游离酚的方式相比，本研究将蓝色小麦多酚的提取量提高了51.5%。