蒸汽爆破-超微粉碎米糠膳食纤维对2型糖尿病小鼠的降血糖作用

徐田辉 苏 玉 黄 亮 付晓康 贺 便

(特医食品加工湖南省重点实验室；中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410004)(稻谷及副产品深加工国家工程实验室；中南林业科技大学食品科学与工程学院2，长沙 410004)

米糠是从糙米精制中得到的副产物，由大多数皮层、胚胎、糊粉层和少量的胚乳组成，约占水稻总质量的10%[1]。中国年产米糠约1 200万t，但综合利用率低，有效利用率低于20%。米糠除了含有脂肪、多糖、蛋白质、维生素、矿物质外，其膳食纤维含量也较为丰富。膳食纤维可以降低冠心病、糖尿病和肥胖的风险，摄入足够的膳食纤维还可以帮助降低便秘、憩室病和其他消化道疾病的发生率[2]。

蒸汽爆破是一种较新的食品加工技术，采用高温高压蒸汽处理纤维原料，通过瞬时减压过程实现原料的成分分离[3]。与其他预处理方法相比，蒸汽爆破可以显著降低能耗与成本，减少危害[4]。白晓洲等[5]的研究表明，蒸汽爆破法可显著提高沙棘中可溶性膳食纤维的含量；康芳芳等[6]的研究表明，蒸汽爆破可以显著提高豆渣中可溶性膳食纤维的含量。

膳食纤维的生理作用早已引起人们的关注，它可以通过各种机制改善2型糖尿病患者的血糖、血脂和体重[7]。因此，合理使用膳食纤维对糖尿病患者的饮食治疗非常有益。世界卫生组织和欧洲食品安全局都建议在日常饮食中加入一定量的膳食纤维。膳食纤维改善糖尿病患者病情然后发挥治疗作用的机制尚不十分清楚，然而，膳食纤维是肠道中有益细菌的食物来源，补充摄入膳食纤维可以增强人体有益肠道菌群的代谢，并产生多种有益的生物活性物质，从而调节人体新陈代谢。因此，膳食纤维对糖尿病和相关病症的有效控制可能与有益肠道菌群的代谢调节有关[8,9]。

在初步的基础研究中，发现米糠膳食纤维在蒸汽爆破-超微粉碎复合改性后具有良好的膨胀性，保水能力和脂肪吸收能力[10,11]。因此，为了研究米糠膳食纤维是否可以降低2型糖尿病小鼠的血糖水平，将经过蒸汽爆破-气流粉碎复合改性和蒸汽爆破-纳米粉碎复合改性的米糠膳食纤维悬浮于蒸馏水中，并采用高糖高脂饮食和低剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病小鼠模型，分析不同改性方法的米糠膳食纤维对2型糖尿病小鼠血糖水平、血脂水平、肝脏和胰腺组织的影响，为米糠膳食纤维改善2型糖尿病提供参考[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

50只体重18～26 g的BALB/c小鼠雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，无特定病原体(specific pathogen free, SPF级，动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002)，动物饲养许可证号：SYXK(湘)2014-0012。

基础饲料：蛋白质 35.6%、脂肪 44.3%、碳水化合物 20.1%；高糖高脂饲料：基础饲料63.6%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、蛋黄粉10%、蔗糖15%、猪油10%。

经蒸汽爆破超微粉碎复合改性得到的两种不同粒径的米糠膳食纤维：蒸汽爆破-气流粉碎米糠膳食纤维和蒸汽爆破-纳米粉碎米糠膳食纤维。

盐酸二甲双胍缓释片(95%纯度)、链脲佐菌素(98%纯度含异构体)、A111-2型总胆固醇(分析纯)、A112-1型高密度脂蛋白胆固醇(分析纯)、A113-1型低密度脂蛋白胆固醇(分析纯)、A110-1型总甘油三酯(分析纯)、A-001-1型超氧化物歧化酶(酶活≥2 500 u/mg)、A003-1型丙二醛(分析纯)、A043型肝糖原(分析纯)和A045-2型考马斯亮蓝G-250测定试剂盒(分析纯)。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

DHG-92425A鼓风干燥箱，FE20K数字式pH/mv计校准仪，722分光光度计，DNM-9602A酶标仪，TG16KR台式高速冷冻离心机，GA-3型血糖仪，GA-3型血糖试纸。

1.3 方法

1.3.1 米糠膳食纤维的获取与复合改性

将脱脂米糠在60 ℃下干燥，通过100目筛压碎，调节至pH4.5，并在60 ℃的水浴中搅拌2 h与蒸馏水以1∶12(m∶V)的比例混合煮沸30 min，将溶液的pH调节至6.5，然后加入0.3%的热稳定α-淀粉酶(耐高温)，并在95 ℃下酶水解持续30 min[13]。将溶液调至pH7.5，然后加入0.6%碱性蛋白酶，在60 ℃温度下酶水解2 h，酶在水浴中冷却至室温，最后将滤液干燥，得到米糠膳食纤维。将制得的米糠膳食纤维通过蒸汽爆破-气流粉碎和蒸汽爆破-纳米粉碎进行改性，分别得到两种复合改性米糠膳食纤维粉[14]。

1.3.2 电子扫描显微镜测量复合改性后的米糠膳食纤维粒径并确定其结构

取适量干燥样品，用导电胶将其固定在样品台上，喷金100 s加速电压从低到高逐渐上升到5 kV，工作距离为10 mm在不同的放大倍数下观察样品颗粒的形态，并分析样品的形态，分别测量两种复合改性米糠膳食纤维中各组分的含量[15]。

1.3.3 小鼠高糖高脂模型的建立

选取50只18～26 g SPF级BALB/c小鼠雌雄各半，先用基础饲料适应性喂养1周后称量体重，分性别按体重随机分为10组，每组5只，其中雌、雄的第1组喂基础饲料，其余8组喂高糖饲料并分性别对小鼠进行编号后继续喂养3周后，禁食12 h，造模组腹腔注射1% 链脲佐菌素溶液(60 mg/kg b.w)，连续注射3d，对照组腹腔注射相同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液[16]。

链脲佐菌素注射5～7 d后禁食3～5 h，尾部取血测空腹血糖值，选取血糖水平大于11.1 mmol/L的小鼠建立糖尿病动物模型。

1.3.4 小鼠的分组及给药

造模成功小鼠按性别随机分成8组，即基础对照组、高糖模型组、阳性对照组、糖尿病灌胃蒸汽爆破-气流粉碎组和糖尿病灌胃蒸汽爆破-纳米粉碎组，剪脚趾进行编号。其中基础对照组继续喂养基础饲料，高糖模型组继续喂养高糖高脂饲料。基础对照组和高糖模型组小鼠每天灌胃蒸馏水(20 mL/kg)；阳性对照组每天灌胃盐酸二甲双胍缓释片溶液(7.5 mg/mL)；蒸汽爆破-气流粉碎组和蒸汽爆破-纳米粉碎组分别每天灌胃蒸汽爆破-气流粉碎、蒸汽爆破-纳米粉碎加纯净水配制成浓度为0.14 g/mL的悬浮液(均为现用现配)，灌胃体积22 mL/kg。连续灌胃4周，期间自由摄食、饮水。灌胃期间每天观察记录小鼠的摄食状况、精神状态、毛发情况。4周结束后禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球取血，分离血清测定血脂水平。全部小鼠脱臼处死迅速解剖取肝脏、胰腺组织等器官观察并称重，其余部分于-80 ℃冰箱中待分析[17,18]。

1.3.5 小鼠血糖水平的测定

每周第7天上午10:00测定小鼠空腹血糖值，将灌胃前后各组小鼠的空腹血糖值与模型对照组进行配对分析。

1.3.6 小鼠肝脏总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶值以及肝糖原的测定

取0.5 g肝脏组织块剪碎置于玻璃匀浆管中，加入4.5 mL 0.86%冷生理盐水进行匀浆，将制备好的10%匀浆用离心机2 000 r/min左右离心10～15 min，取上清液于EP管中待测，采用酶学方法检测肝脏组织中总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的含量[19]。

按试剂盒要求，分别检测肝脏中丙二醛、超氧化物歧化酶以及糖原含量，具体操作按试剂盒说明进行。

表1 米糠膳食纤维的成分表/g/100 g

1.3.7 小鼠肝脏及胰腺组织形态学观察

将小鼠肝脏及胰腺组织用9%中性福尔马林固定48 h，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，透蜡，包埋，脱蜡切片，苏木精-伊红(HE染色)，显微镜观察肝脏及胰脏组织结构。

2 结果与讨论

2.1 两种复合改性米糠膳食纤维的电镜扫描

从图1中可以看出，在60倍和10k镜头下，蒸汽爆破-纳米粉碎的粒径小于蒸汽爆破-气流粉碎粒径，粒度分布相对均匀。米糠膳食纤维的基本组成如表1所示，经过蒸汽爆破-超微粉碎的米糠膳食纤维，其可溶性膳食纤维的含量明显增加，且经过蒸汽爆破-纳米粉碎的米糠膳食纤维，其可溶性膳食纤维的含量增加更明显。

注：1:蒸汽爆破-气流粉碎, 2:蒸汽爆破-纳米粉碎, a:×60 倍镜, b:×10k倍镜。图1 米糠膳食纤维扫描电镜图

2.2 米糠膳食纤维对小鼠血糖水平的影响

通过小鼠血糖含量变化分析比较由图2可知，糖尿病小鼠的血糖水平明显升高，说明造模成功；灌胃初期，阳性对照组血糖明显降低，说明受到阳性药物的治疗有明显的效果，米糠膳食纤维组在灌胃初期无明显效果，但在后期血糖有一定程度的降低，并低于高糖模型组；阳性对照组、蒸汽爆破-气流粉碎组、蒸汽爆破-纳米粉碎组在实验结束时的血糖值，雌鼠分别比之前降低了18.3%、4.9%和6.4%，雄鼠分别比之前降低了18.4%、4.2%和13.2%，说明米糠膳食纤维有降血糖的作用，这是因为在溶液中有较大黏性的水溶性膳食纤维能将葡萄糖分子包裹在其中，从而降低小鼠对葡萄糖的吸收，且改性处理后的米糠膳食纤维中的水溶性膳食纤维含量显著增加，有效提高了小鼠对葡萄糖的吸附能力。从图2可以看到米糠膳食纤维干预组的降血糖效果相比于对照组来说降幅不是很明显，可能是因为所灌胃的米糠膳食纤维的浓度太低，但是从宏观上来说，其确实对于小鼠起到了一定的降血糖作用，这与李耀东等[20]的研究结果一致。说明米糠膳食纤维有助于延缓和降低餐后血糖，升高血清胰岛素水平，维持餐后血糖的平衡和稳定，避免血糖水平的剧烈波动。

图2 米糠膳食纤维对小鼠血糖水平的影响

2.3 米糠膳食纤维对小鼠生理指标的影响

由图3可知，与基础对照组相比，糖尿病对照组的小鼠肝脏中的总甘油三酯、总胆固醇均显著升高，糖尿病小鼠多伴发血脂代谢紊乱，且高糖高脂饮食会增加小鼠的肝脏脂质水平，促使脂肪肝的形成。虽然米糠膳食纤维干预组的血脂水平未能达到基础对照组，但是已经显著降低了小鼠血清的总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的浓度，并且随着米糠膳食纤维粒度的减小，其血脂浓度逐渐降低，其中蒸汽爆破-纳米粉碎组小鼠血脂水平较高糖模型组下降显著，说明了蒸汽爆破-纳米粉碎组有较好的吸附胆固醇的功效。张薇等[21]研究表明燕麦膳食纤维对小鼠肠道中的胆固醇具有一定的吸附作用，与本研究结果一致。

从图3中可以看出，患糖尿病的小鼠的超氧化物歧化酶活力明显低于基础对照组，其中高糖模型组差异极显著(P<0.01)，表明高糖高脂饮食降低了机体抗氧化能力，阳性对照组、蒸汽爆破-气流粉碎组和蒸汽爆破-纳米粉碎组小鼠的肝脏超氧化物歧化酶酶活性与DC组相比均极显著提高(P<0.01)，分别是高糖模型组的258.52%和237.30%(阳性对照组雌性和雄性)、234.01%和207.52%(蒸汽爆破-气流粉碎组的雌性和雄性)、255.32%和213.33%(蒸汽爆破-纳米粉碎组的雌性和雄性)，可以看出米糠膳食纤维干预组中，蒸汽爆破-纳米粉碎组的干预效果最理想，对肝组织的保护最明显，且该组小鼠的超氧化物歧化酶的活力与基础对照组之间不存在显著性差异(P>0.05)。

由图3可知，高糖模型组小鼠的肝脏中丙二醛的含量与基础对照组相比极显著性增加(P<0.01)；与高糖模型组相比，干预组雌性小鼠的丙二醛值均显著下降(P<0.05)，雄性小鼠呈极显著下降(P<0.01)，这表示米糠膳食纤维能有效的清除体内的自由基，抑制脂质的过氧化；由图3分析可知，米糠膳食纤维干预组均有较强的清除自由基的能力，效果均较为明显。但马正伟等[22]的研究表明，长期高剂量的复合膳食纤维会导致高脂血症大鼠肝脏形态结构和功能发生改变，且有不良影响。本研究所灌胃的米糠膳食纤维为复合型膳食纤维，但其剂量相对于小鼠仍较低，但不排除其对小鼠肝脏的损坏作用，后期还需在高剂量方面展开一定的研究。

注：不同的符号表示存在显著性差异。

图4 米糠膳食纤维对小鼠胰腺组织的影响

2.4 米糠膳食纤维对小鼠肝糖原的影响

由表2可知，患糖尿病的小鼠体内肝糖原的含量均低于正常小鼠，高糖模型组与基础对照组相比较差异显著(P<0.05)，雄性小鼠阳性对照组、蒸汽爆破-纳米粉碎组较高糖模型组差异显著(P<0.05)，但雌性各组除阳性对照组外均不显著，可能是因为而动物肝糖原的分析结果直接受到动物的生理习性、样品放置时间、提取方式等因素的影响。

表2 米糠膳食纤维对小鼠肝糖原含量的影响

2.5 米糠膳食纤维对小鼠肝脏组织的影响

通过解剖发现，基础对照组小鼠的肝脏正常，外观光滑，分叶清晰，大小正常，颜色呈鲜红色。高糖模型组肝脏肿大，色泽发黄变白。与高糖模型组相比，阳性对照组、蒸汽爆破-气流粉碎组和蒸汽爆破-纳米粉碎组小鼠的病变均有所减轻。但蒸汽爆破-纳米粉碎组相对于阳性对照组以及蒸汽爆破-气流粉碎组，其肝脏更加饱满，且色泽均匀，无红色淤血情况出现，这种情况可能是阳性对照组在给药的同时，药物存在一定的副作用，对小鼠肝脏有轻微的损伤作用。

2.6 米糠膳食纤维对小鼠胰腺组织的影响

由图4可知，基础对照组(a♀)和(a♂)胰腺组织结构清楚，可以观察到完整的胰岛结构，胰岛呈圆形且数量较多、无脂肪增生、没有出现充血、炎症等组织病变；而糖尿病对照高糖模型组(b♀)和(b♂)，小鼠胰腺组织结构不清晰、胰岛排列混乱、血管舒张、充血和坏死，出现严重的病理学变化；与高糖模型组相比，干预组的胰腺组织情况较为良好，虽也出现了不同程度的充血和坏死等病变，但程度明显较轻，其中阳性对照组(c♀)和(c♂)只有较轻的表面脂肪组织增生，蒸汽爆破-纳米粉碎组(e♀)和(e♂)的胰腺组织与高糖模型组小鼠相比，胰岛细胞数量增多，大部分腺末房细胞未见肿胀。佐兆杭等[23]的研究表明，杂豆膳食纤维能够通过所干预的组分中多糖的直接作用，提高大鼠机体内抗氧化活性酶的间接作用，从而起到对胰腺的修复作用。本研究所灌胃干预的米糠膳食纤维中，蒸汽爆破-纳米粉碎组中膳食纤维的可溶性膳食纤维组分较蒸汽爆破-气流粉碎组高，其所含的多糖组分也较高，其对胰腺组织的保护作用也相对较强。

3 结论

利用不同复合改性处理的米糠膳食纤维干预2型糖尿病小鼠，通过对糖尿病小鼠的各项生理指标的测定，研究米糠膳食纤维对2型糖尿病小鼠血糖水平的影响。改性后的米糠膳食纤维中的水溶性膳食纤维含量显著增加，有效提高样品对葡萄糖吸附能力；同时米糠膳食纤维有效降低了小鼠体内的血脂水平，并对其肝脏及胰腺组织的病变有很好的改善，胰岛发炎症状也逐渐好转。病理切片中两种不同粒径的米糠膳食纤维相较，可以看出复合改性后的米糠膳食纤维组的细胞形态较为规律完整，表明米糠膳食纤维能有效减少高糖高脂饮食造成的肝脏组织病变形成的脂肪空泡和胰腺组织胰岛的充血和坏死，保护机体，且经蒸汽爆破-纳米粉碎复合改性米糠膳食纤维较蒸汽爆破-气流粉碎米糠膳食纤维，对2型糖尿病小鼠机体的保护作用效果更明显。