中国部分地区鸡传染性贫血流行病学调查及病原分离鉴定

李 岳，闫娜娜，刘爱晶，兰兴鸽，杨 搏，刘长军，高玉龙，高宏雷，祁小乐，崔红玉，高 立，李 凯，潘 青，王永强，张艳萍，王笑梅

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150069）

鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CAV）是圆环病毒科环状病毒属的成员之一，引起2～4 周龄鸡群发生传染性贫血综合征（CIA）[1]。CAV 无囊膜，病毒颗粒呈20 面体对称，平均直径为25 nm～26.5 nm。CAV 的基因组为单股负链环状DNA，大小为2 298 bp 或2 319 bp，编码3 种病毒蛋白（VP1、VP2 和VP3），其中VP1 为病毒主要结构蛋白，是病毒编码的3 个蛋白中变异率最大的蛋白，其高变区位于aa139～aa151；VP2 为非结构蛋白，是CAV 最保守的蛋白，具有双重特异性蛋白磷酸酶活性；VP3 又称为凋亡素，诱导肿瘤细胞凋亡。

自1979 年Yuasa 等在日本首次分离到CAV（Gifu-1 株）[2]，随后英国、美国、澳大利亚等均有该病的报道，目前，该病呈全球性流行，给养禽业带来了严重的经济损失。我国于1992 年首次分离并报道了该病毒[3]，随后，广西、江苏、山东、广东等地也陆续报道了该病的流行[4-7]。目前，CAV 只有一个血清型，但是不同地区CAV 分离株之间序列存在差异，毒力也有所不同[8-9]。为了解近年来CAV 在我国规模化养鸡场的流行情况，2016 年1 月～2019 年9月，对黑龙江、北京、山东等13 个省市疑似CAV阳性鸡场进行PCR 检测，并于MDCC-MSB 1 细胞中分离得到1 株CAV，并对分离株VP1 基因进行了序列分析。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源和细胞2016 年1 月～2019 年9月，从山东（30 个）、内蒙古（18 个）、湖南（8 个）、北京（22 个）、江苏（16 个）、黑龙江（121 个）、辽宁（49 个）、甘肃（4 个）、宁夏（3 个）、吉林（71 个）、广西（15 个）、河南（16 个）和安徽（8 个）等13 个省市疑似发病的381 个鸡群中采集肝脏病料样品共1 677 份，病料样品于-20 ℃保存备用。鸡马立克氏病脾淋巴瘤继代细胞系（MDCC-MSB 1 细胞）由本实验室保存。

1.2 主要试剂1640 细胞培养基、FITC 标记的兔抗鼠IgG 购自Sigma 公司；胎牛血清购自Gibco 公司；Primer Star 高保真DNA 聚合酶、Ex TaqDNA 聚合酶、pMD18-T 载体、DL2000 Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA 提取试剂盒购自AxyGen公司；质粒pCAGGs-VP1 及CAV VP3 单克隆抗体（BC11）由本实验制备与保存。

1.3 引物设计与合成根据CAV 参考株Cux-1 基因组序列（M55918.1），设计合成引物CAV VP1R/F，用于扩增CAV VP1 基因。参照文献分别合成CAV[10]、鸡马立克氏病病毒（MDV）[10]、网状内皮组织增生症病毒（REV）[10]、禽白血病病毒（ALV）[10]及禽腺病毒（FADV）[11]（表1）。上述引物均由吉林库美生物科技股份有限公司合成。

表1 实验用引物序列Table 1 Sequences of the primers used in the present study

1.4 病料样品中CAV 的检测无菌取发病鸡肝脏，加入1 mL PBS，利用高通量组织研磨仪研磨破碎，震荡研磨两次，获得组织匀浆液后6000 r/min离心5 min，取200 μL 上清，利用DNA 提取试剂盒提取病毒DNA，利用引物CAVR/F 进行PCR 检测。统计2016 年1 月～2019 年9 月来自疑似发病的381 个鸡群1 677 份肝脏样品中的CAV 阳性样品数量及阳性鸡群数量。

1.5 病料样品中其它免疫抑制病的检测取经检测为CAV 阳性的病料样品DNA，采用MDV、REV、ALV 及FADV 特异性引物（MDVR/F、REVR/F、ALVR/F 及FADV R/F）分别进行PCR 检测。统计分析CIA 与其它免疫抑制病混合感染情况。

1.6 病毒分离与鉴定

1.6.1 病毒分离 取来自山东临沂某CAV 阳性鸡场采集的肝脏样品研磨上清，70 ℃金属浴加热5 min去除外源囊膜病毒，6000 r/min 离心5 min，取上清经0.22 μm 滤器过滤除菌，接种MDCC-MSB 1 细胞，37 ℃、5% CO2条件下培养3 d。收获接毒细胞，反复冻融3 次，2000 r/min 离心3 min，收集上清，按25%比例接种MDCC-MSB 1 细胞，连续传代6 次，反复冻融后收集上清储存于-80 ℃冰箱备用。1.6.2 PCR 鉴定 取1.6.1 分离获得的病毒液200 μL，提取病毒DNA后，利用引物CAV R/F进行PCR检测。

1.6.3 间接免疫荧光（IFA）鉴定 取第6 代病毒液接种MDCC-MSB 1 细胞，于37 ℃、5%CO2条件下培养3 d 后，采用预冷的95%酒精固定于48 孔板，以CAV VP3 MAb BC11（1∶400）为一抗，FITC 标记的兔抗鼠IgG（1∶200）为二抗进行IFA 鉴定。

1.6.4 分离病毒的VP1 基因克隆、测序及序列分析取1.6.2 病毒DNA 为模板，利用引物CAV VP1R/F 扩增CAV VP1 基因，回收PCR 产物并克隆至pMD18-T载体，转化DH5α 感受态细胞，选取3 个菌液PCR鉴定为阳性的单克隆，由吉林库美生物科技股份有限公司测序。采用DNAStar 软件对分离病毒株VP1基因及GenBank 中19 株参考株VP1 基因进行序列比对及分析，采用MEGA 6.0.软件绘制遗传进化树。

2 结 果

2.1 病料样品中CAV 的检测结果对采集的1 677份疑似CIA 阳性肝脏病料样品进行PCR 检测。结果显示，CAV 阳性肝脏病料样品242 份，平均阳性率为14.43%（242/1677），鸡群阳性率达到22.31%（85/381）；各年样品CAV 阳性率5.36%～16.54%，鸡群阳性率12.50%～25.69%（表2）。

对13 个省市中疑似发病的381 个鸡群进行调查，结果发现，CAV 感染普遍存在于调查的13 个省市中，鸡群阳性率12.50%～50%。其中，黑龙江省为调查鸡群数目最多的省份，共有121 个疑似CAV 发病鸡群，阳性率为24.79%（表3）。

表2 2016 年1 月～2019 年9 月我国部分 地区CAV 的检测结果Table 2 CAV detection in some areas of China during January 2016-September 2019

表3 2016 年1 月～2019 年9 月我国部分地区CAV 阳性鸡群的分布Table 3 The distribution of CAV-positive flocks in some areas of China during January 2016-September 2019

2.2 病料样品中其它免疫抑制病病毒检测结果取经检测为CAV 阳性的病料样品DNA，进行CAV 与其它免疫抑制病病毒混合感染情况检测，结果显示，2016 年1 月～2019 年9 月，单独感染CAV 鸡群比率为47.06%（40/85），与其它免疫抑制病病毒混合感染率为52.94%（45/85）。混感类型包括CAV 与MDV、CAV 与ALV、CAV 与REV 双重感染，CAV、MDV 与ALV 三重感染，CAV、MDV、REV 与ALV四重感染等，其中，CAV 与MDV 双重感染占混合感染的比例为61%（图1）。表明CAV 与其他免疫抑制病病毒混合感染在调查鸡场中普遍存在，并且CAV 与MDV 双重感染为最主要的混合感染类型。

图1 调查鸡群中CAV 及其他免疫抑制病病毒混合感染的检测结果Fig.1 Detection of CAV and other immunosuppressive diseases in chicken flocks

2.3 病毒分离株的鉴定结果

2.3.1 PCR鉴定 将PCR检测为阳性的来自山东临沂某CAV 阳性鸡场的1份肝脏处理液接种MDCC-MSB 1细胞，连续传代6 次后，提取其细胞培养物上清DNA，采用引物CAV F/R 进行PCR 扩增。结果显示在约600 bp 获得与阳性对照（pCAGGs-VP1）一致的条带（图2），初步表明从山东临沂某CAV 阳性鸡场的肝脏病料样品中分离到1 株CAV。

图2 CAV-SD19/4604 分离株PCR 检测Fig.2 PCR detection of CAV-SD19/4604 isolate

2.3.2 分离株IFA 鉴定结果 将收获的P6 代病毒液接种MDCC-MSB 1，利用IFA 对分离病毒株作进一步鉴定，同时以空白细胞为对照。结果显示，接种P6 代病毒液的细胞出现明显的绿色荧光（图3A），而空白细胞未见荧光（图3B），进一步证明分离到1株CAV，命名为CAV-SD19/4604。

图3 IFA 鉴定分离株CAV-SD19/4604Fig.3 IFA identification of CAV-SD19/4604 isolate

2.4 分离株VP1 同源性及遗传进化分析利用引物CAV VP1R/F PCR 扩增分离病毒株CAV-SD19/4604的VP1 基因，获得1 400 bp 左右目的片段，将目的片段克隆至pMD18-T 中测序。序列分析表明，分离病毒株CAV-SD19/4604 VP1 基因全长为1 350 bp，无基因缺失及插入，并将其上传至GenBank。与Gen-Bank 中登录的19 株CAV 参考株的VP1 基因序列作同源性分析，结果显示分离病毒株VP1 基因与19株参考株VP1 基因的同源性为95.00%～98.80%。对分离株及参考株的VP1 基因绘制遗传进化树，结果显示，CAV-SD19/4604 及参考株VP1 基因可分为Ⅰ、Ⅱ两群，分离株CAV-SD19/46049（MN746999）位于Ⅰ群，并且与C369（AB046590）、HN9（DQ141672）、GD101（KU050680）、GD104（KU050679）、CIA89-69（JF507715）等亚洲病毒株位于同一分支（图4），表明分离病毒株与亚洲流行病毒株亲缘关系较近。

图4 CAV-SD19/4604 分离株VP1 基因的进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on VP1 gene of the isolate CAV-SD19/4604

3 讨 论

CAV 主要攻击鸡的T 细胞以及骨髓中的成血细胞，是引起鸡群发生免疫抑制病的主要病原之一[12]。我国于1992 年由崔现兰等首次分离报道该病毒后，广西、安徽、山东等地也相继发现了该病的流行。2016 年1 月～2019 年9 月，本研究对13 个 省市的疑似发病鸡群开展调查，发现了较高的CAV 阳性鸡群（22.31%），调查结果显示CAV 感染普遍存在于我国13 个省市的规模化养殖场，鸡群中有不同程度的CAV 感染；2016 年1 月～2019 年9 月鸡群CAV阳性率在12.50%～25.69%，表明近年来CAV 感染在我国呈现稳定趋势，但并未暴发CIA 疫情。对越南北部10 个省份的64 个鸡群进行检测，CAV 普遍存在于检测省份中并且阳性鸡群检出率达到73.4%[13]。伊朗全国范围内普遍存在CAV，鸡群阳性率58.4%[14]。CAV 与MDV、REV 或ALV 等免疫抑制病病毒的混合感染，可使CAV 的致病性增强，鸡群病症加剧，死亡增加；这可能是引发目前我国部分地区鸡群多种疾病暴发，使养鸡业的疫病更加复杂和严重的主要原因之一[15]。对2016 年1 月～2019 年9 月鸡群中CAV及其他免疫抑制病病毒检测结果显示，CAV 混合感染其他免疫抑制病病毒为主要感染类型，占据CAV感染总量的52.94%；值得注意的是，调查的85 个CAV 阳性鸡群中，共检测出26 个鸡群（57.78%）为MDV 阳性，但是CAV 与其他免疫抑制病病毒混合感染比例不高，表明在本次调查中，CAV 与MDV 混合感染为最常见的混感类型，鸡群中MD 的免疫失败可能与CAV 早期感染有关[16]。

CAV 可以在T 细胞系MDCC-MSB 1 细 胞、1 日龄鸡或鸡胚中增殖。本研究用来自山东临沂某CAV 阳性鸡场的肝脏病料样品接种MDCC-MSB 1 细胞，传代6 次收集病毒液，经PCR 及IFA 鉴定获得1 株CAV 细胞适应毒，命名为CAV-SD19/4604。对其VP1 基因与GenBank 中19 株参考株VP1 基因进行同源性分析发现，分离病毒株与中国分离株GD104 亲缘关系最近，同源性为98.80%。同时，采用MEGA对分离株及其他病毒株绘制遗传进化树，结果显示，CAV-SD19/4604 与大多数亚洲分离株位于同一分支，具备亚洲流行株的特征。据报道，VP1 蛋白的394 位氨基酸是主要的毒力决定位点，若394 位为谷氨酰胺（Q），则具备高致病性病毒株特征，相对应的，若病毒株394 位氨基酸为组氨酸（H），则为低致病性病毒株[17]。在本研究中，分离株CAVSD19/4604 VP1 蛋白394 氨基酸为谷氨酰胺（Q），具备高致病性病毒株特征。Renshaw 等人研究发现，VP1 蛋白139 及144 位氨基酸影响着病毒增殖及传播能力[18]，分离株VP1 蛋白的139 位氨基酸为赖氨酸（K），144 位氨基酸为谷氨酸（E），CAV-SD19/4604可以在易感细胞MDCC-MSB 1 中正常增殖传播。

本研究调查了我国部分地区CAV 感染情况，CAV 普遍存在于调查鸡群中并且与多种免疫抑制病病病毒混合感染，使鸡群处于免疫抑制状态，增加了鸡群对其他病原体的易感性及免疫失败的风险。因此，加强CAV 流行情况的监测，剔除CAV 阳性鸡群对我国养鸡业健康发展具有重大意义。