黑加仑稳定增殖体系的建立

许丁帆，刘艳军*，范丽娜，施丽婷，杨静慧

(1.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300)

黑加仑(RibesnigrumL.)学名黑穗醋栗，为虎耳草科茶藨子属小型灌木，成熟果实为黑色小浆果，既可鲜食又可以加工成果汁、果酱等食品。黑加仑含有丰富的维生素、花青素、黄酮类等物质，有着极高的保健功能和经济价值[1-2]。目前已经知道的黑加仑的保健功效包括预防痛风、贫血、水肿、关节炎、风湿病、口腔和咽喉疾病、咳嗽等[3]。

黑加仑生产育苗主要以扦插繁殖为主[4-5]，生产效率低，长此以往会导致品种退化。对黑加仑的研究主要集中于药用有效成分与保健功能和优质丰产栽培方面[6-8]。利用组织培养技术进行黑加仑的稳定增殖研究鲜见报道。刘文萍[9]以黑加仑新枝腋芽和顶芽为外植体，剥离茎尖进行增殖培养，产生大量芽丛而建立快繁体系。而在短时间内使用分裂素产生大量芽丛可能会引起组培苗变异，随着组培代数的增加，组培苗变异逐渐累积，将会影响黑加仑生产质量与经济性状。本试验采用黑加仑腋芽直接萌发，并配合试管扦插技术建立稳定的黑加仑组培增殖体系，对黑加仑工厂化育苗与推广具有一定的指导意义，同时为黑加仑生理生化研究及遗传研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的两年生黑加仑盆栽苗由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 组培苗的获得

为获得黑加仑无菌苗，试验以黑加仑新梢为外植体，在黑加仑新梢快速生长期时，剪取新梢上部约10 cm，剪去顶芽，在超净工作台中剪成2～3 cm的小段，每段带有1个腋芽，剪去叶片，保留部分叶柄。将处理好的黑加仑外植体用75%乙醇打湿后，用40%的安替福民进行表面消毒，消毒时间为5 min，无菌水冲洗外植体3次，每次10 min，并用无菌滤纸吸干后接种到1/2 MS培养基上(30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂粉，pH 6.0)，待腋芽萌发长至3 cm左右时，将其从基部处剪下，继续接种于1/2MS培养基上，经过20 d培养，获得一定数量的黑加仑组培苗备用。培养条件为(25±1)℃，连续光照，光照强度为3 000 lx。

1.2.2 腋芽萌发诱导

在上一步骤获得的黑加仑组培苗中，选取生长健壮的组培苗将其根剪去，接种到黑加仑腋芽诱导培养基上。诱导培养基采用MS培养基为基础培养基，通过改变培养基中无机盐含量，分别添加不同浓度的IAA和赤霉素、不同用量的蔗糖，并采用7 g·L-1琼脂粉固化，调节pH为6.0。每个培养基中接种3个外植体，每个处理重复10次。培养条件为：连续光照，光照强度为3 000 lx，培养温度为25±1 ℃。每天观察记录黑加仑腋芽诱导及生长情况，30 d后，记录统计不同处理的萌发腋芽数及萌芽率。

1.2.3 壮苗培养

待上一步骤腋芽萌发生长至1.5 cm左右时，将其剪下，以试管扦插的方式扦插在黑加仑壮苗培养基上进行培养，壮苗培养基分别为MS、1/2 MS、MS+0.25 mg·L-1IAA、MS+0.5 mg·L-1IAA、MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭、MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭，并依次编号为1、2、3、4、5、6，所有培养基附加20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂粉，调节pH值为6.0。每处理重复10瓶，每瓶接种3个小苗。培养条件与前一步骤相同。每天观察黑加仑的生长情况，30 d后，记录并统计试验结果。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对黑加仑腋芽萌发的影响

本试验通过黑加仑腋芽诱导并结合试管扦插的方式进行黑加仑的快速繁殖，对于保持增殖苗木的遗传稳定性十分有利，为此，在试验中尽可能采取少用激素的方式进行诱导。

由表1可知，采用MS+30 g·L-1蔗糖时，黑加仑腋芽萌发差。当MS+30 g·L-1蔗糖加入0.5 mg·L-1IAA后，有少量腋芽萌发，但萌发的腋芽生长缓慢且茎尖出现玻璃化现象。增加IAA的用量至1.0 mg·L-1后，接种的外植体生长缓慢且基部褐化，腋芽萌发数为0。在培养基配方3的基础上加入2.0 mg·L-1赤霉素，萌发率提高，但萌发的腋芽生长缓慢。在配方4的基础上使用半量MS无机盐后，腋芽萌发率明显提高，腋芽的生长速度加快。在此基础上，又采用20 g·L-1的蔗糖降低培养基的渗透压，结果腋芽萌发率和生长速度均明显改善，且腋芽生长健壮。综合以上试验结果，黑加仑腋芽萌发诱导培养基的理想配方是：1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖。

表1 不同培养基对黑加仑腋芽萌发的影响结果

2.2 不同壮苗培养基对黑加仑生长的影响

当黑加仑小苗在侧芽萌发培养基上培养一段时间后，出现生长点停止生长和植株黄化现象，继代培养后仍不能改善。为了获得黑加仑组培壮苗应选用新的培养基苗，才能顺利移栽入土培养。为此试验采用不同壮苗培养基，目的是获得生长健壮的黑加仑组培苗，具体情况见表2。

表2 黑加仑在壮苗培养基上的生长结果

从表2可以看出，黑加仑壮苗培养过程中，激素和活性炭对其生长影响较大。在MS和1/2MS培养基上，外植体生长缓慢且根部均出现褐变现象，但综合发根数和平均生长高度，MS培养基优于1/2MS。在MS培养基中加入IAA后，外植体生长速度加快，说明一定量的外源生长素能够促进外植体生长，但在培养后期，外植体生长点出现停止生长现象，且随着IAA用量的增加，这种现象还会加重，甚至导致生长点死亡。在培养基中添加适量活性炭之后，能有效缓解根部褐变，同时也可抑制生长点停止生长现象，说明活性炭对黑加仑组培苗生长起到促进作用。根据以上试验结果，在MS+0.25 mg·L-1IAA+2 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖上可获得生长健壮的黑加仑组培苗。

3 讨论

3.1 组培快繁中引起遗传变异的主要原因

在植物组培快繁研究中经常会出现组培材料遗传变异的现象[10-11]，这对于利用组培技术进行植物营养繁殖极为不利。引起组培材料遗传变异的因素很多，主要有以下几个方面：第一，植物激素的使用[12]，植物激素在促进细胞分裂和分化的同时，也会造成细胞遗传物质发生变化，从而引起变异；第二是再生方式[13]，通过愈伤组织再生途径容易引起细胞变异，因此，在组培快繁中应避免通过愈伤组织再生或通过形成不定芽再生，本试验选择黑加仑腋芽萌发可以很好地避免变异的发生；第三，是采用衰老的外植体作为增殖培养材料[14]，植物细胞衰老后容易出现变异现象；此外，培养过程中不良的组培条件和微生物等都可能导致组培材料的变异，因此，应针对这些影响因素做好防范，才能建立良好稳定遗传的组培快繁体系。

3.2 试管扦插与生长点增殖在组培快繁中各自优势的比较

试管扦插和生长点增殖是建立植物组培快繁体系最常用的方法。如童虹宇等[15]对金佛山兰丛芽诱导进行组培快繁、黄俊轩等[16]通过腋芽增殖获得丛生芽建立北美海棠组培快繁体系；另一种是试管扦插，试管扦插出现较晚，本试验采用的方法就属于试管扦插。生长点增殖主要是利用植物组织生长点在低浓度激素作用下可以分化出大量的芽丛，然后通过分割这些芽丛来进行植株的扩繁，这种技术在组培快繁初期应用较多。采用生长点增殖的方法可以快速获得芽丛，能在短期内得到较多的植株，在繁殖系数上占据优势；而试管扦插的方法虽然繁殖系数较低，但可以在较短时间内获得移栽苗，且其遗传稳定性较高。比较以上两种方法，从实用角度来看，试管扦插更具有优势，这也是近年来其成为组培快繁主要方式的原因。试管扦插，省工省力，可以一次成苗，避免了多次继代时的人工费，这对于劳动力紧张的现今社会尤为重要。同时，采用生长点增殖的方法相对试管扦插使用植物激素的种类及用量会偏多，这些激素可能会引起组培苗出现遗传变异现象。

3.3 活性炭对组培苗生长的影响

本试验中，在培养基中添加适量的活性炭对组培苗的生长有积极作用，有利于组培壮苗的形成。活性炭对于植物组培材料的生长影响很多，主要可以归纳为以下方面：第一，可以缓解培养基中激素、盐分、渗透压等不良因素对植株的影响[17]，因为活性炭可以吸附这些物质，并能缓慢释放，从而起到了缓冲作用，减小了这些物质对植物材料的损害；第二，可以吸附植物材料释放的有害代谢物[18-19]，从而减小这些代谢物对植物生长造成的伤害，如本试验中采用活性炭，可以很好的吸附黑加仑组培苗代谢产物，减轻根部褐变并缓解生长点坏死现象。当前对活性炭作用的原理仍不太清楚，对于大多数植物而言在培养基中添加适量的活性炭有利于其生长，提高成苗率等。但在使用时应注意使用量，过量会造成植株材料营养不良，同时要注意使用时的颗粒大小等。

4 小结

本试验通过对黑加仑腋芽诱导并结合试管扦插技术，筛选黑加仑壮苗培养基，建立了黑加仑稳定的组培增殖体系。其具体步骤总结如下：选取黑加仑新稍作为外植体，经外植体消毒后，获得黑加仑无菌苗；去除无菌苗根系转接到腋芽萌发诱导培养基1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖上，待腋芽萌发后从基部剪下接种到壮苗培养基(MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖)上进行培养，获得黑加仑组培壮苗。本试验结果可以直接用于黑加仑苗木的组培快繁生产和相关研究中。