紫甘薯花青素对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障损伤的修复作用*

朱成雷， 穆晶晶， 徐静雯， 王琳琳， 周郑坤， 郑元林， 陈才法△

（江苏师范大学 1健康科学学院，2生命科学学院，江苏徐州221009）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）已经发展成为全球性疾病，其发病率在新兴工业化国家呈上升趋势，而在西方发达国家则一直为高患病率［1］。炎症性肠病主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其中溃疡性结肠炎为其主要形式，其主要临床特征为弥漫性炎症，包括直肠黏膜改变，近端结肠长度改变和更严重的远端结肠病变等［2］，其发病机制目前尚不明确，大多认为是由饮食习惯，环境，免疫调节，肠道微生物等多种因素共同作用的结果［3］。有实验表明，肠上皮屏障功能在溃疡性结肠炎的发病中起着重要作用［4-6］，肠道屏障损伤会使黏膜的通透性增加，使腔内环境中的病原体，毒素和抗原渗透到黏膜组织中，从而诱发炎症［7-8］。紧密连接的完整性决定了肠上皮屏障功能［9-10］，在溃疡性结肠炎患者中，上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 的表达减弱，而在上调了ZO-1、occludin表达后，肠道炎症症状减轻［11-13］。天然产物紫甘薯花青素（purple sweet potato anthacyanin，PSPA）是黄酮类化合物，具有众多药用价值，大量文献报道了其抗氧化，抗肿瘤和降血脂等功效［14-16］。.已有实验证明原花青素对于肠炎中紧密连接蛋白具有一定的调节作用［17-18］，但紫甘薯花青素对于肠黏膜屏障的作用尚无相关报道。本研究主要探讨紫甘薯花青素对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠上皮紧密蛋白表达的影响，为进一步开发和研究有关治疗方法提供理论基础。

材料和方法

1 药物、试剂和仪器

葡聚糖硫酸钠（相对分子质量36 000～50 000 Mw；MP Biomedicals）；青岛花青素干粉（青岛鹏远康华天然产物有限公司；色价E1%1cm=106）；兔抗GAPDH单克隆抗体购自Abways Technology；兔抗ZO-1 多克隆抗体、兔抗 occludin 多克隆抗体、鼠抗 TNF-α 单克隆抗体和兔抗IL-6多克隆抗体均购自Proteintech；隐血测试盒（联苯胺法）购自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海生物生工有限公司；糖原PAS 染色液和天狼星红染色试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司；5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）购自北京酷尔化学有限公司。TGL-18000CR 高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；TS2R 倒置荧光显微镜（Nikon）；ESP-300电泳仪，VE-180 垂直电泳槽和VE-186 转移电泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 实验动物

雄性 BALB/c 小鼠（42 只，体重 25～30 g）购自南京医科大学，许可证号为SCXK（苏）2016-0002。

3 方法

3.1 小鼠造模与分组治疗 将小鼠分为正常饮水组（normal组）、模型（model）组、紫甘薯花青素（12.5、25、50 和75 mg/kg）组和5-ASA（75 mg/kg）阳性药物对照组，每组各6 只，实验前适应性喂养2 周。采用2.5% DSS 溶液自由饮用构建小鼠溃疡性结肠炎模型，每3 d 配制一次新鲜的DSS 溶液。除正常组给予蒸馏水外，其余各组采用自由饮用2.5%的DSS 溶液连续7 d，诱导溃疡性结肠炎模型，第8天开始全部换成蒸馏水。造模第1 天即开始灌胃给药，除正常组与模型组给予蒸馏水外，其余各组通过灌胃方式给予相对应剂量的药物，连续给药8 d。

3.2 小鼠结肠标本的采集 实验期间，每天观察并记录小鼠的体重变化、活动情况、毛发色泽、大便性状和便血情况。造模第9 天脱颈处死小鼠。所获的肠管分成两份，一份固定于4%的多聚甲醛，4℃处理3 d 后，将其转移至70%的无水乙醇于-20℃冰箱保存，另一份则于-80℃超低温冰箱中保存。

3.3 溃疡性结肠炎的评估 通过对小鼠体重变化、疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分判断标准见表1，用结肠长度、组织学损伤来评估小鼠的溃疡性结肠炎的治疗情况和是否成功构建溃疡性结肠炎模型。取预先通过4%多聚甲醛固定后的结肠组织，常规石蜡包埋，4 μm切片，HE染色后在光学显微镜下观察结肠组织病变情况，并对小鼠结肠组织切片进行组织学损伤评分，判断标准见表2。每个组织切片随机选取3个以上高倍视野（×400），由2人进行盲法评分，取平均值作为最终结果。

表1 疾病活动指数评分判断标准Table 1.The score scales for the disease activity index

表2 组织学损伤评分判断标准Table 2.The criterion for judgement of histological injury score

3.4 免疫组织化学法检测相关蛋白的表达 小鼠结肠组织经4%的多聚甲醛固定后，石蜡切片。经二甲苯和梯度乙醇脱蜡后使用柠檬酸钠修复液，用电磁炉沸水中加热，对其进行抗原热修复，3%的过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，山羊血清封闭非特异性抗原，加 I 抗兔抗 ZO-1（1∶50），兔抗 occludin（1∶50）、鼠抗 TNF-α（1：200）和兔抗 IL-6（1∶200）4℃过夜。后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，之后经DAB 显色、苏木素复染、流水返蓝、梯度乙醇溶液和二甲苯脱水，盖玻片封片。显微40 倍物镜下随机选择3 个以上视野拍照，利用Image J 软件对所测目的蛋白进行半定量分析，以其阳性蛋白所占面积表示蛋白表达强度。

3.5 糖原PAS 染色检测结肠组织杯状细胞中黏液素的表达 小鼠结肠组织石蜡切片经脱蜡和水化后，蒸馏水浸洗，滴加高碘酸溶液，室温放置1.5 h，蒸馏水浸洗，滴加希夫试剂于37℃烘箱中浸染20 min，蒸馏水冲洗10 min，入苏木素染核1.5 min，酸性乙醇分化3 s，蒸馏水冲洗10 min，使其返蓝，逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察拍照。

3.6 Western blot 法检测小鼠结肠ZO-1 和occludin的表达 实验第9天，取小鼠结肠组织，用RIPA裂解液裂解后匀浆，提取小鼠结肠组织总蛋白，BCA 法测定所得蛋白浓度，8%～12%的SDS-PAGE 分离蛋白，后将蛋白转移至PVDF 膜上，转膜后在10%的牛奶中室温下封闭1 h，后膜于5%BSA 稀释的Ⅰ抗中4℃孵育过夜，加入带有HRP标记的Ⅱ抗稀释液，室温孵育2 h，ECL 法发光，胶片显影，扫描，保存图片，ImageJ软件分析结果。

3.7 天狼星红染色检测小鼠结肠纤维化情况 小鼠结肠石蜡切片经脱蜡和水化后，滴加天狼星红染色液，室温孵育1 h，流水简单冲洗，苏木素染核8 min，流水冲洗10 min，返蓝，脱水，显微镜下观察，拍照。

4 统计学处理

本文所有数据均采用Graphpad Prism 6 软件进行分析。各组之间的统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较，数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 紫甘薯花青素对于溃疡性结肠炎小鼠体重、疾病活动指数、结肠长度及组织学改变的影响

造模第 9 天，正常组、模型组和12.5、25、50、75mg/kg 紫甘薯花青素组小鼠体重差异明显。与模型组相比，紫甘薯花青素治疗组小鼠体重下降趋势明显得到抑制，体重显著增加（P＜0.05），见图1A。其DAI 指数依次0.00±0.00、11.67±0.52、10.00±1.10、3.83±0.75、5.33±0.82、8.17±1.94和7.17±1.60。与正常组相比，模型组小鼠的DAI 评分显著增加，但紫甘薯花青素治疗组与模型组相比DAI 评分显著降低（P＜0.01），见图1B。同样紫甘薯花青素治疗组也能改善由于肠炎引起的小鼠肠道变短，见图1C，紫甘薯花青素能够明显增加结肠长度。通过HE 染色来观察小鼠结肠组织学改变，正常组小鼠结肠结构完整，无炎症，隐窝完整，杯状细胞丰富；模型组小鼠结肠壁明显增厚，炎症严重，病变深度达浆膜层，隐窝完全被破坏，杯状细胞消失；各剂量紫甘薯花青素组以及阳性药物对照组均能改善炎症引起的组织学改变，其中25 mg/kg 组改善效果最为明显，其治疗效果明显优于高浓度的PSPA 组，见图2。其组织学评分见表3。

Figure 1.The effects of purple sweet potato anthocyanins on body weight（A），disease activity index（B）and colonic length（C）in ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=6.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.图1 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠体重、疾病活动指数和结肠长度的影响

Figure 2.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological injury in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with HE staining were showed（×400）.图2 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠组织学损伤的影响

表3 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠组织学评分的影响Table 3.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological score of ulcerative colitis mice（Mean±SEM. n=4）

2 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠肠道紧密连接蛋白表达的影响

由图3可见，紧密连接蛋白ZO-1和occludin在正常组中呈阳性表达分布，多为棕黄色染色；与正常组相比，模型组中ZO-1和occludin这2个蛋白的表达均降低，各剂量紫甘薯花青素组以及阳性药物对照组这2个蛋白的表达均有所升高，其中25 mg/kg的紫甘薯花青素治疗组效果最优（P＜0.01）。Western blot结果同免疫组化结果类似，同样也表明25 mg/kg 的紫甘薯花青素对紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 的表达上调效果最优，见图4。

3 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子表达的影响

如图5所示，模型组小鼠结肠中炎症因子TNF-α和IL-6 的表达较多，但经过紫甘薯花青素治疗后，其中炎症因子表达分布降低，且25 mg/kg 的紫甘薯花青素治疗组结肠中的炎症因子表达分布最少（P＜0.01），要优于阳性对照药物的治疗效果。

4 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠黏液素表达的影响

如图6所示，通过PAS染色技术将小鼠结肠组织杯状细胞中的粘液素染成紫红色，模型组中粘液素的表达与分布明显低于正常组，但经治疗后杯状细胞中的黏液素表达与分布明显增多，且其中25 mg/kg紫甘薯花青素治疗组杯状细胞中的黏液素表达与分布较模型组相比增加最为明显。

5 紫甘薯花青素对于溃疡性结肠炎小鼠肠道纤维化程度的影响

如图7 所示，通过天狼星红染色来观察小鼠结肠组织的纤维化情况。模型组的纤维化情况较正常组明显加重，纤维化主要集中在黏膜下层，经紫甘薯花青素治疗之后，小鼠纤维化情况得到明显改善，黏膜下层胶原纤维减少，且其中25 mg/kg 紫甘薯花青素治疗组治疗效果最为明显。

讨 论

随着人们饮食习惯的改变，目前溃疡性结肠炎的患病率在全球范围内呈持续上升趋势，其已经严重影响了人们的健康。本文以紫甘薯花青素针对肠屏障功能的修复作用来探讨其对溃疡性结肠炎的治疗效果。

Figure 3.The effects of purple sweet potato anthocyanin on the expression and distribution of intestinal tight junction proteins in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with immunohistochemical staining were showed（×400）.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.图3 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠肠道紧密连接蛋白表达及分布的影响

我们以DSS 为造模药物，通过2.5%DSS 水溶液自由饮用的方式来构建小鼠溃疡性结肠炎模型。该造模方法简单，重现性好，临床症状及病理学改变与人体溃疡性结肠炎模型类似，适用于针对溃疡性结肠炎药物作用的研究［19］。通过体重下降、疾病活动指数、结肠长度等可以确定模型是否构建成功。本文成功构建了小鼠溃疡性结肠炎模型，造模后，小鼠均表现出体重下降，进食减少，出现血便等现象，且通过结肠组织学观察也显示出小鼠结肠缩短，黏膜糜烂，黏膜下层、浆膜层均被破坏，而阳性对照药物5-ASA 组与紫甘薯花青素治疗组小鼠结肠的组织学状况均优于模型组，炎症症状明显得到改善，故紫甘薯花青素对于溃疡性结肠炎具有治疗效果。

在正常情况下，肠道具有完整的屏障功能，能防止肠腔内致病性抗原侵入机体，维持机体正常运行。但当肠上皮紧密连接蛋白受损后，腔内各种病原微生物侵入机体，引起黏膜的炎症和免疫反应［20］。本文通过检测紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 在结肠中的分布与表达来判断结肠的肠道屏障完整性。实验发现，紫甘薯花青素能够明显改善由溃疡性结肠炎引起的肠道屏障受损，经免疫组织化学技术检测发现模型组中紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 在结肠中的分布较正常组减少，炎症因子IL-6 和TNF-α 的分布较正常组增加，经Western blot 检测发现紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 在模型组中表达下降，炎症因子TNF-α 在模型组中表达上升，证明溃疡性结肠炎小鼠的肠道屏障已经受损。但是经过PSPA 治疗后，紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 在结肠中的分布与表达较模型组均有明显上升，且炎症因子IL-6 和TNF-α 的分布与表达均有显著下降。黏液素为杯状细胞分泌的，覆盖在胃肠道上皮细胞表面的黏液，其能够隔离上皮细胞与各种病原微生物的接触，当炎症发生后，杯状细胞受损，黏液素分泌减少［21］。利用PAS糖原染色可以将小鼠结肠中的黏液素染成紫红色。经实验发现，模型组中的黏液素明显减少，但紫甘薯花青素治疗组中小鼠结肠组织中的黏液素较模型组明显增多。表明紫甘薯花青素可能通过维持肠道屏障的完整性来抑制炎症的发生，从而达到减轻炎症的目的。

Figure 4.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of ZO-1 and occludin in the ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.图4 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠肠道紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达的影响

组织重塑和纤维化是炎症性肠病的特征，在溃疡性结肠炎中，结肠黏膜下层的纤维肌闭塞，结肠纤维化严重［22-23］。利用天狼星红染色可以将结肠中的胶原纤维染成红色。经实验发现，紫甘薯花青素能够有效缓解由溃疡性结肠炎引起的结肠纤维化状况。

综上所述，在由DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，体重变化，疾病活动指数，组织学评分，结肠长度以及结肠纤维化程度均反映紫甘薯花青素能够明显改善溃疡性结肠炎小鼠的症状。紧密连接蛋白，炎症因子以及黏液素的表达情况，初步证明了，紫甘薯花青素可能通过维护肠道屏障的完整性来阻止外界病原微生物进入肠内，从而达到抑制炎症产生的目的，且其并非呈现出随剂量上升治疗效果越好的趋势，只有在25 mg/kg 紫甘薯花青素组中治疗效果最优。DSS 主要是通过增加肠道通透性以及损伤肠道屏障来发展肠道炎症，其主要影响上皮细胞紧密连接蛋白如ZO-1 和occludin 等来损伤肠道屏障，从而增加TNF-α和IL-6 等炎症因子的表达［24-26］。经本实验研究发现，紫甘薯花青素主要通过增加紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 的表达与分布来保护肠道屏障完整性，从而抑制炎症因子TNF-α 和IL-6 的释放，改善由DSS 诱导的溃疡性结肠炎症状。本实验为紫甘薯花青素的药理研究与功能开发提供了一些实验依据。

Figure 5.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of TNF-α and IL-6 in the ulcerative colitis mice by immunohistochemical staining（×400）of colon sections of mice（A）and TNF-α expression by Western blot（B）.Mean±SEM. n=3.#P＜0.05 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.图5 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子TNF-α和IL-6表达和分布的影响

Figure 6.The effect of purple sweet potato anthocyanin on mucin expression in the ulcerative colitis mice.Glycogen PAS staining of colon sections of mice was showed（×400）.图6 紫甘薯花青素对溃疡性结肠炎小鼠黏液素表达的影响

Figure 7.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the degree of intestinal fibrosis in ulcerative colitis mice.Sirius red staining of colon sections of mice was showed（×400）.图7 紫甘薯花青素对于溃疡性结肠炎小鼠肠道纤维化程度的影响