抑制lncRNA LUCAT1表达通过靶向调控miR-204-3p减轻高糖诱导的心肌H9c2细胞损伤*

陈婉斐， 泮慧俐， 李珍珍， 卢慧琴

（1台州市中心医院心血管内科，浙江台州318000；2台州市第一人民医院新生儿科，浙江台州318020）

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的可导致心力衰竭的一种病理状态［1］，其发病机制与心肌细胞凋亡和氧化应激损伤密切相关［2-4］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 nt 的非编码 RNA，微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类长度在22 nt 左右的内源性单链非编码RNA，两者均不参与编码蛋白质但参与基因的调控，且可相互作用，在细胞增殖、凋亡、氧化应激等过程中发挥着重要作用，其表达和功能异常与包括糖尿病心肌病在内的多种疾病的发生发展密切相关［5-7］。近年来，有学者指出，lncRNA 肺癌相关转录本1（lung cancer-associated transcript 1，LUCAT1）高表达与糖尿病心肌病的发病机制有关，抑制其表达对高糖（high glucose，HG）诱导的心肌细胞损伤具有抑制作用［8］，但具体的作用机制并不完全清楚。miR-204-3p在lncRNA AK139328介导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤过程中发挥着重要的抑制作用［9］。本研究采用生物信息学软件预测发现LUCAT1 与miR-204-3p 之间存在互补的结合位点，推测抑制LUCAT1 表达可能通过靶向调控miR-204-3p抑制心肌细胞凋亡和氧化应激，进而发挥心肌保护作用。因此本研究开展体外细胞实验加以验证，旨在进一步揭示敲减LUCAT1 表达减轻HG 诱导的心肌细胞损伤的分子机制，为LUCAT1 成为糖尿病心肌病治疗的靶点提供新线索。

材料和方法

1 主要材料

大鼠心肌H9c2 细胞株购于中科院上海生命科学研究所。DEME 培养基购于HyClone；胎牛血清购于杭州四季青公司；Trizol试剂和Lipofectamine 2000购于Invitrogen；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒购于南京建成生物公司；RIPA 裂解液、CCK-8 试剂盒、萤光素酶报告基因检测试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物技术公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；抗Bax、Bax 和GAPDH抗体购于Cell Signaling Technology；辣根过氧化物酶标记的II 抗购于北京中杉金桥生物公司；miR-204-3p mimics、miR-204-3p inhibitor 及相应的阴性对照mimics-NC 和inhibitor-NC 购于上海吉玛基因公司；靶向LUCAT1 的干扰序列siRNA-LUCAT1 及其阴性对照siRNA-NC购于广州锐博生物公司；PCR引物购于上海生工生物工程有限公司。凝胶成像系统购于Bio-Rad；流式细胞仪购于Beckman Coulter；荧光定量PCR 仪购于Applied Biosystems；多功能酶标仪购于Tecan；超微量分光光度计购于Implen；CO2培养箱购于Thermo。

2 方法

2.1 细胞培养、分组与转染 将解冻复苏后的H9c2 细胞以含 5.5 mmol/L D-葡萄糖的 DMEM 培养基（内含10%胎牛血清）在5% CO2、37℃细胞培养箱中常规培养。实验分为：（1）对照（control）组：正常培养72 h；（2）HG 组：以含25.5 mmol/L D-葡萄糖的高糖 DMEM 培养基培养 72 h；（3）HG+siRNA-NC组：转染siRNA-NC 48 h后用高糖DMEM 培养基培养24 h；（4）HG+siRNA-LUCAT1 组：转染 siRNA-LUCAT1 48 h后用高糖培养基培养24 h；（5）HG+siRNALUCAT1+inhibitor-NC 组：共转染 siRNA-LUCAT1 和inhibitor-NC 48 h 后用高糖培养基培养 24 h；（6）HG+siRNA-LUCAT1+miR-204-3p inhibitor 组：共转染siRNA-LUCAT1和inhibitor-NC 48 h 后用高糖培养基培养24 h。每组设置3 个复孔。将生长良好的对数生长期H9c2 细胞按照每孔5×105个接种至6 孔细胞板，置于细胞培养箱中常规培养；待细胞融合度达70%左右时，按照上述分组根据Lipofectamine 2000说明书分别将siRNA-LUCAT1、siRNA-NC、miR-204-3p inhibitor和inhibitor-NC 转染 H9c2 细胞。转染 5 h后更换新鲜培养基继续培养。培养48 h 后，根据实验分组以高糖培养基继续培养24 h。

2.2 双萤光素酶报告基因实验检测LUCAT1 和miR-204-3p 的靶向结合关系 采用生物学信息学软件对LUCAT1 的靶基因进行预测，发现miR-204-3p与LUCAT1 存在互补的结合位点，将该片段克隆重组至萤光素酶报告载体上，构建LUCAT1 野生型载体质粒，标记为LUCAT1-WT；同时，将miR-204-3p 与LUCAT1结合位点定点突变后，克隆重组至萤光素酶报告载体上，构建LUCAT1 突变型载体质粒，标记为LUCAT1-MUT。参照Lipofectamine 2000 说明书将LUCAT1-WT、LUCAT1-MUT 质粒分别与 miR-204-3p mimics、mimics-NC 共转染至 H9c2 细胞中，其中每个处理设置3 个平行孔；转染48 h 后，收集各组细胞并参照萤光素酶活性检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞的萤光素酶活性。实验重复3次。

2.3 RT-qPCR检测LUCAT1和miR-204-3p的表达Trizol 法提取H9c2 细胞的总RNA 后，采用微量分光光度计检测RNA 的浓度、纯度及完整性。将高质量的RNA 参照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA；将cDNA 作为模板，按照荧光定量PCR 检测试剂盒说明书上PCR 仪进行扩增。反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，38 个循环；循环结束后，72℃再延伸5 min。所用到的PCR 引物序列如下：LUCAT1 的上游引物序列为5'-GCTCGGATTGCCTTAGACAG-3'，下游引物序列为5'-GGGTGAGCTTCTTGTGAGGA-3'；GAPDH的上游引物序列为5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物序列为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；miR-204-3p 的上游引物序列为5'-ACACTCCAGCTGGGGCTGGGAAGGCAAAGGG-3'，下游引物序列为5'-CTCAACTGGTGTCG-TGGA-3'；U6 的上游引物序列为5'-CTCACTTCGGCAGCACATA-3'，下游引物序列为5'-AACTCTTCACGATTTTGTCTGTC-3'。

2.4 CCK-8 法检测细胞的活力 将对数生长期的H9c2 细胞按照每孔 1×105个接种至 96 孔细胞板，置于细胞培养箱中培养过夜；将其按照2.1 中的分组与处理，并将无细胞的培养基作为空白调零孔；处理72 h 后，每孔加入 CCK-8 工作液 100 μL；孵育 4 h 后，采用多功能酶标仪检测H9c2 细胞在490 nm 波长处的A值，并计算出各组细胞的相对活力。细胞相对活力（%）=（实验组A值-调零组A值）/（对照组A值-调零组A值）×100%。实验重复3次。

2.5 LDH 试剂盒检测LDH 漏出量 按照2.1 中的分组处理H9c2 细胞72 h 后，收集各组细胞上清液，参照LDH试剂盒说明书步骤检测各组细胞上清液中LDH活性。实验重复3次。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 按照2.1 中的分组处理H9c2 细胞72 h 后，收集各组细胞，以预冷的磷酸盐缓冲液洗涤 2 次后，加入 1× binding buffer 制成浓度为1×109/L的细胞悬液；取细胞悬液100 μL于样品管中，加入5 μL annexin V-FITC 和5 μL PI；混匀后，室温避光放置15 min；补加1× binding buffer 400 μL后，1 h内上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

2.7 Western blot 检测细胞中 Bcl-2和Bax 蛋白的表达 向H9c2 细胞中加入RIPA 裂解液抽提细胞总蛋白后，参照BCA 蛋白检测试剂盒说明书检测蛋白的浓度与纯度；将蛋白样品按照1∶1 比例与上样缓冲液混匀后，以每孔50 μg 上样至SDS-PAGE 凝胶孔中行电泳分离；电泳结束后，转至PVDF 膜上。采用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h 后，加入按照1∶1 000比例稀释的抗Bcl-2、Bax 和GAPDH 抗体；4℃孵育过夜后，加入按照1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的II 抗；室温孵育2 h 后，滴加化学发光剂；暗室内显影曝光后，以GAPDH 为内参，采用凝胶成像系统扫描分析H9c2 细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白的表达水平。实验重复3次。

2.8 比色法检测SOD和GSH-Px活性及MDA含量按照2.1 中的分组处理H9c2 细胞后收集细胞，反复冻融破碎细胞后，1 000 r/min 离心10 min；取200 μL上清液后，参照SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量检测试剂盒说明书步骤检测各处理组中SOD 和GSHPx活性及MDA含量。实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。实验结果取3 次实验的均值，结果以均数±标准差（mean±SD）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析和SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 LUCAT1和miR-204-3p的靶向结合关系

LncBase Predicted v.2 软件预测到 LUCAT1 和miR-204-3p 之间存在互补的结合位点，见图1A。采用双萤光素酶报告基因实验进一步检测LUCAT1 和miR-204-3p 的靶向结合关系，结果显示，与阴性对照mimics-NC 组比较，miR-204-3p mimics 与 LUCAT1-WT 质粒共转染后H9c2 细胞的萤光素酶活性明显降低（P＜0.05），但miR-204-3p mimics 与LUCAT1-MUT质粒共转染后H9c2 细胞的荧光素酶活性差异无统计学显著性（P＞0.05），见图1B。

Figure 1.The complementary binding sites between LUCAT1 and miR-204-3p（A）and the changes of luciferase activity（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs mimics-NC group.图1 LUCAT1和miR-204-3p之间存在互补的结合位点及萤光素酶报告基因实验的验证

2 转染后各组心肌细胞中LUCAT1 和miR-204-3p表达水平的变化

与对照组比较，给予HG 刺激后H9c2 细胞中LUCAT1 的表达水平明显升高，而miR-204-3p 的表达水平明显降低（P＜0.05）；与 HG 组比较，转染siRNA-NC 后 H9c2 细 胞中 LUCAT1和miR-204-3p 的表达水平差异均无统计学显著性（P＞0.05），但转染siRNA-LUCAT1 后 H9c2 细胞中 LUCAT1 的表达水平明显降低，miR-204-3p 的表达水平明显升高（P＜0.05）；与HG+siRNA-LUCAT1 组比较，转染inhibitor-NC 对H9c2 细胞中miR-204-3p 的表达水平无明显影响（P＞0.05），但转染 miR-204-3p inhibitor 后H9c2 细胞中 miR-204-3p 的表达水平明显降低（P＜0.05），见图2。

3 LUCAT1 低表达靶向调控 miR-204-3p 对 HG 环境下心肌细胞活力和LDH漏出量的影响

与对照组比较，HG 组H9c2 细胞的活力明显降低，而 LDH 漏出量明显升高（P＜0.05）；与 HG 组比较，转染siRNA-NC 后H9c2 细胞的活力和LDH 漏出量均无显著改变（P＞0.05），但转染siRNA-LUCAT1后H9c2细胞的活力明显升高，而LDH 漏出量明显降低（P＜0.05）；与HG+siRNA-LUCAT1组比较，转染inhibitor-NC 对H9c2 细胞的活力和LDH 漏出量无明显影响（P＞0.05），但转染miR-204-3p inhibitor 后H9c2细胞的活力明显降低，而LDH 漏出量明显升高（P＜0.05），见图3。

Figure 2.Comparison of expression levels of LUCAT1 and miR-204-3p in H9c2 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.图2 各组H9c2 细胞中LUCAT1 和miR-204-3p 表达水平的比较

4 LUCAT1 低表达靶向调控 miR-204-3p 对 HG 环境下心肌细胞凋亡的影响

与对照组比较，HG组H9c2细胞的凋亡率明显升高（P＜0.05）；与HG 组比较，转染siRNA-NC 对H9c2细胞的凋亡无明显影响（P＞0.05），但转染siRNALUCAT1 可明显抑制 HG 诱导的 H9c2 细胞凋亡（P＜0.05）；与HG+siRNA-LUCAT1 组比较，转染inhibitor-NC 对H9c2 细胞的凋亡无显著影响（P＞0.05），但转染miR-204-3p inhibitor后siRNA-LUCAT1对HG 环境下H9c2 细胞凋亡的抑制作用明显减弱（P＜0.05）， 见图4。

Figure 3.Comparison of the viability（A）and LDH leakage（B）in the H9c2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.图3 各组H9c2细胞活力和LDH漏出量的比较

Figure 4.The apoptosis of the H9c2 cells in each group detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.图4 流式细胞术检测各组H9c2细胞凋亡的变化

5 LUCAT1 低表达靶向调控 miR-204-3p 对 HG 环境下心肌细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

与对照组比较，HG 组H9c2细胞中Bcl-2的蛋白表达水平明显降低，而Bax 的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与HG 组比较，转染siRNA-NC 对H9c2细胞中Bcl-2 和Bax 的蛋白表达水平无明显影响（P＞0.05），但转染 siRNA-LUCAT1 可明显上调 HG 环境下H9c2 细胞中Bcl-2 的蛋白表达并下调Bax 的蛋白表达（P＜0.05）；与HG+siRNA-LUCAT1 组比较，转染inhibitor-NC 对 H9c2 细胞中 Bcl-2和Bax 的蛋白表达水平无明显影响（P＞0.05），但转染miR-204-3p inhibitor 可明显逆转 siRNA-LUCAT1 对 Bcl-2 蛋白表达的促进及对Bax 蛋白表达的抑制作用（P＜0.05），见图5。

Figure 5.The protein expression of Bcl-2 and Bax in the H9c2 cells of each group determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.图5 Western blot检测各组H9c2细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达

6 LUCAT1 低表达靶向调控miR-204-3p 对心肌细胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影响

与对照组比较，HG 组H9c2细胞的SOD 和GSHPx 活性均明显降低，而MDA 含量明显升高（P＜0.05）；与 HG 组比较，转染 siRNA-LUCAT1 可明显逆转 HG 引起的 H9c2 细胞 SOD和GSH-Px 活性及 MDA含量的变化（P＜0.05），但转染siRNA-NC 对HG 环境下 H9c2 细胞的 SOD和GSH-Px 活性及 MDA 含量无显著影响（P＞0.05）；与HG+siRNA-LUCAT1 组比较，转染 inhibitor-NC 对 HG 环境下 H9c2 细胞的 SOD 和GSH-Px活性及MDA含量无显著影响（P＞0.05），但转染miR-204-3p inhibitor 可明显逆转siRNA-LUCAT1对 HG 环境下 H9c2 细胞 SOD和GSH-Px 活性及 MDA含量的作用（P＜0.05），见图6。

Figure 6.The activity of SOD and GSH-Px and the content of MDA in the H9c2 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.图6 各组H9c2细胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量的比较

讨 论

糖尿病是一种快速增长的流行疾病，而糖尿病心肌病是其最主要的并发症之一，对糖尿病患者的生命健康和生活质量带来很大的威胁［10］。血糖升高与糖尿病心肌病的发生发展密切相关，高血糖可诱导心肌细胞凋亡和氧化应激损伤，改变心肌结构与功能，进而加重糖尿病心肌病的发生发展［11-12］。本研究以含25.5 mmol/L D-葡萄糖［13］的高糖培养液培养大鼠心肌细胞后发现，心肌细胞活力、SOD 活性、GSH-Px 活性和抑凋亡蛋白Bcl-2 表达水平均明显降低，而细胞膜损伤指标LDH 释放量、细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表达水平和氧化应激指标MDA 含量均明显升高，即HG 可引起心肌细胞凋亡，促进氧化应激反应的发生，降低细胞活力。这表明HG诱导的大鼠心肌细胞损伤模型构建成功。在糖尿病心肌病患者中存在着异常表达的lncRNAs，而这些lncRNAs 可能通过调控HG 诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激反应介导心肌细胞损伤，参与糖尿病心肌病的发生发展［5，14-15］。作为 lncRNAs 家族成员，LUCAT1（又名SCAL1）定位于人5 号染色体上，由香烟烟雾抽提物诱导产生，在肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤中异常高表达，且可通过调控细胞增殖和迁移等发挥着重要的调控作用［16］。此外，LUCAT1 异 常活化可通过下调DNMT1 表达参与 PM2.5诱导的细胞凋亡［17］。近年来有研究发现，糖尿病心肌病的发展机制与LUCAT1有关，敲减LUCAT1 的表达能减轻HG 诱导的心肌细胞损伤［8］，但具体的保护机制并不完全清楚。

miRNAs 是一类广泛存在于生物体内的内源性非编码RNA，其异常表达可通过调控细胞增殖、凋亡和氧化应激反应等参与包括糖尿病心肌病在内的多种疾病的发生发展［18-20］。lncRNAs 常被作为 miRNA的海绵吸附因子，可通过竞争性结合miRNA 在转录后水平调控miRNA 的表达而发挥功能［21］。本研究采用生物信息学软件对LUCAT1 的靶基因进行预测，发现miR-204-3p 与LUCAT1 之间存在潜在相互作用。研究显示，miR-204-3p 异常表达可调控细胞凋亡和氧化应激反应与白内障等疾病的发病有关［22］。过表达 miR-204-3p 通过靶向缓激肽 B2 受体在HG 诱导的足细胞凋亡和功能障碍中发挥保护作用［23］。此外，在糖尿病心肌缺血再灌注损伤心肌细胞和组织中miR-204-3p 表达下调，抑制lncRNA AK139328 通过上调miR-204-3p 减轻心肌细胞缺血再灌注损伤［9］。本研究结果显示，HG 刺激后心肌细胞中LUCAT1 表达上调，而miR-204-3p 表达下调；采用双萤光素酶报告基因实验证实，LUCAT1 可与miR-204-3p 靶向结合降低心肌细胞的萤光素酶活性；此外，成功下调LUCAT1 表达可明显抑制HG 诱导的心肌细胞凋亡和Bax 蛋白表达，降低LDH 释放量和MDA 含量，并上调心肌细胞中miR-204-3p 表达和Bcl-2 蛋白表达，提高心肌细胞活力及SOD 和GSH-Px 活性；而成功下调miR-204-3p 表达后，LUCAT1 低表达对HG 诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激反应的抑制作用明显逆转。本研究结果表明，敲减LUCAT1 的表达可通过靶向上调miR-204-3p 抑制HG诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激反应，从而减轻心肌细胞损伤。下一步我们将研究miR-204-3p是否特异影响凋亡和氧化应激相关蛋白的表达进而影响HG诱导的心肌细胞损伤。

综上所述，敲减LUCAT1 的表达可通过靶向调控miR-204-3p 表达抑制心肌细胞凋亡和氧化应激，从而减轻HG 诱导的心肌细胞损伤。这为在糖尿病心肌病中调控LUCAT1 的表达水平以保护心肌细胞提供了新的参考依据。