基于血清代谢物的血管内皮功能障碍预测模型研究

血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化性心血管病可检测到的最早期病理改变，被认为是心血管事件的独立预测因子[1-2]。如今心血管病已是造成我国居民死亡和疾病负担的首要原因[3-4]，开展人群血管内皮功能障碍的筛查对于识别心血管病早期危险个体及其早期预防具有重要的现实意义。目前血管内皮功能可靠的无创性评价方法是通过超声测量肱动脉血流介导的血管舒张功能（FMD）[5]，但FMD 检测需要专业人员进行操作，对现场检测环境和受检者要求较高[6]，并且在现场检测耗时较长等，导致其在一些人群现场调查中的实施可行性较低。

近年来研究发现，血管内皮功能障碍与内皮细胞代谢密切相关[7-8]，代谢产物如血清尿酸的改变可提示机体血管内皮功能障碍的发生[9]。为此，本研究基于气相色谱—飞行时间质谱（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC-TOF-MS）技术的非靶标代谢组，检测血管内皮功能障碍者和正常者的血清代谢物。利用血清差异代谢物构建血管内皮功能障碍预测模型并进行验证，为识别人群中血管内皮功能障碍的个体提供一种参考方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象

于2015 年在广西壮族自治区两乡镇现场招募常住居民795 名。纳入标准：（1）禁食至少8 h；（2）年龄18～80 岁。排除标准：（1）患有冠心病、外周动脉疾病、脑卒中（22 例）；（2）近3 天服用血管舒张药、降血脂药或其他药物（253 例）；（3）FMD 缺失（7 例）。排除282 人后，两乡镇共纳入513 名居民，将其中一个乡镇383 名居民按血管内皮功能不同状态（FMD＜6%为血管内皮功能障碍，FMD≥6%为血管内皮功能正常[10]）分为两类，按照年龄和性别进行整体匹配，最后共纳入77 名居民作为建模组，用以模型构建；从另一乡镇130 名居民中抽取26 名作为外验证组，用以模型外部验证。共纳入103 例研究对象。本研究经广西医科大学伦理委员会审批（批准文号：20130306-2），所有研究对象均已被告知研究目的与内容并同意参加研究。

1.2 调查方法

经由统一培训的调查人员对研究对象进行问卷调查、体格检查和血样采集。问卷调查收集研究对象性别、年龄、吸烟、饮酒情况等基本信息，体格检查获取身高、体重、血压，FMD 等资料。现场采集研究对象外周静脉血4～5 ml，分离血清后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 肱动脉FMD 检测

以超声测量的肱动脉FMD 为金标准评价研究对象血管内皮功能。FMD 检测遵循《内皮依赖性血流介导的肱动脉血管舒张的超声评估指南》[6]，采用血管内皮功能检测仪（UNEXEF38G，日本）在室温、安静、光线较暗的环境下进行检测。受检者静坐休息至少15 min 后进行检测。检测时，受检者处于平卧位，暴露右上臂。将血压计袖带缚于右上臂，H 型探头置于右侧手臂肘上约5～10 cm 的肱动脉部位，测量安静状态下肱动脉基础直径，记为D0。保持探头位置不变，将血压计袖带加压至高于收缩压50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以阻断血流，5 min后放开袖带，测量袖带放开后30～120 s 内反应性充血最大扩张直径，记为D1。FMD=[（D1-D0）/D0]×100%。

1.4 血清代谢物测定

代谢物测定参考文献[11]的方法，取100 µl 血清于1.5 ml 离心管中，加入350 µl 甲醇和20 µl L-2-氯苯丙氨酸（内标），混匀，在4℃下以13 000 转/min 的转速离心15 min。取400 µl 上清于2 ml 经甲烷硅基化的进样瓶中。每个样本各取4 µl 于新进样瓶中，混匀，作为质控样本。真空干燥样本后，加入50 µl甲氧胺盐（溶于吡啶，20 mg/ml），轻轻混匀后，置于80℃烘箱中孵育30 min。随后向样本中加入70 µl N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含体积比为1%的三甲基氯硅烷），混匀后在70℃烘箱中孵育2 h，将样本冷却至室温。向质控样本中加入10 µl 饱和脂肪酸甲酯标准混合液（溶于氯仿C8-C16:1 mg/ml；C18-C24:0.5 mg/ml），混匀。

样本采用Agilent 7890 GC-TOF-MS（Agilent公司，美国）进行检测，采用不分流模式，进样量1 µl，载气为氦气。前进样口吹扫流速3 ml/min，柱流速1 ml/min。柱温：50℃保持1 min，以20℃每分钟的速率上升至310℃，保持6 min。前进样口和传输线温度分别为280℃和270℃。离子源温度220℃，电离电压-70 eV，扫描方式50～500 m/z，扫描速率20 pectra/s，溶剂延迟366 s。

应用Chroma TOF 4.3X 软件和LECO-Fiehn Rtx5数据库对色谱峰进行提取、数据基线过滤和校正、峰对齐、反卷积分析、峰定性和半定量。采用保留时间指数方法进行峰定性，保留时间定性偏差为5 000，采用内标归一化法进行峰定量。通过LECO/Fiehn 代谢组学库对代谢物进行鉴定，相似度越高表明代谢物鉴定越准确。

1.5 统计学方法

应用Stata 13.1 软件进行统计描述和统计分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以构成比（%）表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

采用SIMCA 14.1 软件对建模组代谢数据进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA），并用200 次置换检验判断OPLS-DA 模型是否过度拟合，由此筛选出血管内皮功能障碍者和正常者的差异代谢物。筛选标准为OPLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance in the projection,VIP）值大于1 且两独立样本t检验的P值＜0.05。以血管内皮功能是否障碍为因变量（FMD≥6%=0，FMD＜6%=1），以不同的代谢物（经自然对数转换的相对定量值即代谢物峰面积与内标峰面积之比）组合分别与性别（女=0，男=1）、年龄（连续型变量）作为自变量构建多个Logistic 回归模型。采用AUC 和Hosmer-Lemeshow 拟合优度检验，评价所有Logistic 回归模型的预测能力和校准能力，以ROC 曲线中最靠近左上角的点为模型最佳截断点。

利用建模组数据采用十折交叉验证法对模型进行内部验证，外部验证是采用预测模型对外验证组的研究对象进行预测，分别计算AUC、敏感度和特异度以评价模型预测能力。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者基本特征（表1）

本研究共纳入103 例研究对象，其中建模组77例，平均年龄（57.0±6.5）岁，男性37 例（48.1%）；外验证组26 例，平均年龄（57.0±7.0）岁，男性14例（53.8%）。

表1 两组受试者基本特征［例（%）］

对建模组和外验证组受试者的血管内皮功能障碍者和血管内皮功能正常者进行均衡性检验。表1显示，两组中血管内皮功能障碍者和血管内皮功能正常者在性别、年龄、民族、教育程度、吸烟情况、饮酒情况、高血压、糖尿病和体重指数（BMI）方面差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 PCA 与OPLS-DA 分析结果

建模组代谢数据的PCA 分析结果显示，血管内皮功能障碍者和正常者的得分点存在小部分重叠，区分较显著。为了获得更好的组间分离，进一步进行OPLS-DA 分析。由图1 可看出，所有样本均处于95%CI 内，两组样本得分点完全区分，表明这两类人群的代谢特征有区别。OPLSDA 模型解释率（R2Y）和预测率（Q2）分别为0.949和0.720，置换检验R2和Q2截距分别为0.825和-0.437，表明OPLS-DA 模型可以很好地解释血管内皮功能障碍者和正常者之间的差异性，且不存在过度拟合现象。

图1 建模组正交偏最小二乘法-判别分析得分图（n=77）

2.3 建模组中血管内皮功能障碍者和正常者的血清差异代谢物（表2）

根据建模组OPLS-DA 分析得出的VIP 值，结合两独立样本t检验，筛选出血管内皮功能障碍者和正常者的血清差异代谢物共16 个。与血管内皮功能正常者相比，血管内皮功能障碍者的尿酸、色氨酸、松香酸、蔗糖、果糖、花生酸、β-胸苷、谷氨酸、棕榈油酸、2-甲基戊酸、百里香酚水平相对降低（变化倍数＜1），而尿素、阿拉伯糖醇、尿苷、胞苷酸、来苏糖酸,1,4-内脂的水平相对升高（变化倍数＞1）。

2.4 预测模型建立与评价（表3）

通过构建不同Logistic 回归模型并进行评价与比较，按功效最优原则，其中由性别、年龄、尿酸、色氨酸和尿素为组合的模型在模型构建、内部验证和外部验证时的AUC 值均较大，且拟合优度检验差异无统计学意义（P＞0.05），表明该模型的预测能力和校准能力均较好，确定为本研究预测模型。模型表达式为P=1/{1+exp[-（9.803-0.777×性别-0.204×年龄-0.343×ln 尿酸+0.024×ln 色氨酸+0.808×ln尿素）]}，其中P为发生血管内皮功能障碍的概率预测值。

预测模型AUC 为0.974，95%CI 为0.945～1.000。以ROC 曲线中最靠近左上角的点为模型最佳截断点，其对应的概率预测值为0.666，敏感度和特异度分别为93.8%和93.3%。

表2 建模组中血管内皮功能障碍者和正常者的血清差异代谢物

表3 建模组中血管内皮功能障碍者和正常者的血清差异代谢物组合及模型构建

2.5 预测模型验证

建模组十折交叉验证（内部验证）平均AUC 为0.922（95%CI：0.847～0.997），敏感度和特异度分别为87.5%和91.1%（图2）。十折交叉验证AUC 与模型构建AUC 比较差异无统计学意义（P=0.07），提示预测模型具有良好的稳定性。

运用建立的预测模型对外部验证组26 例受试者进行血管内皮功能障碍预测。若P值≥0.666，则判定为血管内皮功能障碍，反之则判定为血管内皮功能正常。在金标准判定的12 例血管内皮功能障碍者中，模型判定正确11 例，错分为血管内皮功能正常者1 例；在金标准判定的14 例血管内皮功能正常者中，模型判定正确11 例，错分为血管内皮功能障碍者3 例。外部验证AUC 为0.881（95%CI：0.729～1.000），敏感度和特异度分别为91.7%和78.6%（图2），表明模型的预测能力较好。

图2 预测模型内部验证和外部验证散点图

3 讨论

血管内皮功能障碍的分子病理主要表现为一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]，并常伴随氧化应激增加和炎症反应[13]。尿素是鸟氨酸循环的代谢产物，由精氨酸酶催化精氨酸生成。研究已表明，在动脉粥样硬化等以血管内皮功能障碍为特征的疾病中，精氨酸酶活性增强[14-15]，尿素合成增多，而NO 合酶利用精氨酸生成NO 减少。尿酸是体内一种强抗氧化剂，能清除自由基，维持抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的活性[9]。此外，尿酸可与过氧亚硝酸盐结合，防止NO 合酶必需辅酶因子—四氢生物蝶呤被氧化[16]。有研究报道，低水平尿酸可能通过增加氧化应激和减少NO 生成而导致血管内皮功能障碍[17]。色氨酸是人体必需氨基酸，在体内主要通过犬尿氨酸途径分解代谢。吲哚胺2,3 双加氧酶（IDO）是控制色氨酸代谢的限速酶[18]。有研究表明，IDO 在炎症反应中上调[19]，色氨酸分解代谢增强，致其水平降低。因而，血清尿素、尿酸及色氨酸的改变可能与血管内皮功能障碍的分子病理有关。

血管内皮功能评价方法分为有创性和无创性，有创性方法包括冠状动脉内注入血管活性物质，血管内超声等。此类方法可直接评估内皮功能，测量结果可靠，但因为是有创操作并且设备昂贵，使其广泛应用受到限制[20]。目前血管内皮功能评价主要以无创性方法为主，常用的方法主要包括FMD，外周动脉张力测定法（peripheral arterial tonometry,PAT），脉搏波传导速度（PWV）检测。FMD 检测因具有无创性、安全性、可重复性的特点，以及对心血管病具有较好的预测价值而成为最常用的无创技术手段，但同时该检测也存在设备昂贵、对操作者要求高、操作较为复杂与费时等不足[20-21]。PAT 的技术原理与FMD 相似，具有自动化检测和对操作者依赖性小的优势，不足之处在于易受外界环境和自主神经张力的影响[22]，检测的敏感度和重复性不如FMD[23]。PWV 是通过测量体表两个动脉搏动点之间的搏动传导速度评价内皮功能，该方法操作简便，自动化程度高，但其检测过程费时，重复性较低[24]。

虽然评价血管内皮功能的方法众多，但尚未有一种方法能同时满足群体性现场调查中简便、省时、不易受外界环境干扰的需求。目前也尚未发现对血管内皮功能障碍进行预测的相关报道。本研究通过GC-TOF-MS 技术检测血清中代谢物，建立了由性别、年龄、尿酸、色氨酸和尿素为组成的血管内皮功能障碍预测模型，模型总体上具有较好的稳定性和预测能力。GC-TOF-MS 技术可同时对多样本多组分进行检测，样本平均检测时间和检测成本均较低。在实际应用中，只需获取血液样本进行检测即可预测，在一定程度上减少了对现场检测环境的依赖。

本研究存在以下不足。首先，用于模型构建和验证的样本量较少，将来预测模型仍需要更大的样本量在不同特征的群体中进行验证。其次，本次研究对象的纳入标准为18～80 岁人群，但实际入组研究对象的平均年龄为（57.0±6.6）岁，并且主要是乡镇居民，因此该预测模型在应用于年龄较小人群或城市居民时，可能存在一定的局限性。

综上所述，本研究构建的以性别、年龄、尿酸、色氨酸和尿素为组合的血管内皮功能障碍预测模型具有良好的稳定性和较强的预测能力。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突