纳米混悬剂中羟基喜树碱和槲皮素的含量测定及方法学考察

张志坤,蒲晓辉 ,袁 琦

河南大学 药物研究所,河南 开封 475004

喜树碱(camptothecin,CPT)主要是从植物喜树中提取并分离出来的,是具备较强生物学活性的生物碱。羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCTP) 作为喜树碱(CPT)的类似物,是从喜树中提取出来的,并且有更强的抗肿瘤效果[1],对肝癌、胃癌、直肠癌、宫颈癌等均有比较好的效果[2-3]。槲皮素(quercetin,QUR)是一种天然黄酮[4],具有抗炎、抗氧化、抗微生物、免疫调节和抗癌[5-8]等药理作用。相关研究[9]表明,槲皮素具有良好的逆转多药耐药性的作用,主要是可以降低多药耐药相关蛋白过度表达的肿瘤细胞对肿瘤药物的外排作用。

目前,使用单一药物治疗癌症经常会产生耐药性,影响其治疗效果。联合用药可以在一定程度上缓解肿瘤细胞多药耐药的问题。羟基喜树碱具有良好的抗肿瘤活性,但同时也有较强的毒副作用。因此,羟基喜树碱常常采用联合用药的方式用于抗肿瘤治疗。如羟基喜树碱与铂类化合物[10]、抗代谢类抗肿瘤药、其他抗肿瘤药物等多种药物联合用药。本实验在前期制剂研究中,选用了羟基喜树碱和槲皮素作为模型药物,联合应用于肿瘤的治疗。并同时建立测定纳米混悬剂中羟基喜树碱和槲皮素的含量测定方法。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

羟基喜树碱原料药99%(湖北黄石飞云制药);槲皮素原料药98%(南京景竹生物科技有限公司);色谱甲醇(天津四友精细化学品有限公司)。

1.2 实验仪器

分析天平(上海鼎科科学仪器有限公司);W2695型高效液相色谱仪(北京京科瑞达科技有限公司);UV-2600日本岛津公司紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);0.45 μm 无菌滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

分别称取10 mg羟基喜树碱标准品和槲皮素标准品及空白纳米混悬剂,用甲醇进行溶解,在25 mL 棕色容量瓶中定容后作为供试品。取约2 mL的甲醇溶液作为空白对照,在200～600 nm波长范围内进行紫外扫描,确定最佳检测波长。结果见图1。

由图1 所示,羟基喜树碱在222、266、384 nm处吸光度最大,而槲皮素有两个最大吸收,分别在255 nm 和374 nm 处。并且可以观察到羟基喜树碱和槲皮素在374 nm 附近均有较强吸收,且在374 nm 波长处可以有效避免末端吸收和空白材料的干扰。所以,本实验选择374 nm 处作为药物的检测波长。

图1 紫外波长扫描图

2.2 色谱条件

色谱柱:Sino Chrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长374 nm,柱温30 ℃;流速1.0 mL·min-1;进样量20 μL。

2.3 标准曲线的绘制

分别从浓度为25.3 μg·mL-1的羟基喜树碱和25.5 μg·mL-1的槲皮素标准溶液中精密量取10 mL转移至25 mL棕色容量瓶中,使用色谱甲醇进行定容并摇匀,得到浓度为10.12 μg·mL-1的羟基喜树碱和10.2 μg·mL-1的槲皮素标准溶液作为母液。精密量取羟基喜树碱储备液,加色谱甲醇稀释为0.506、1.012、2.024、3.036、4.048、5.06、7.59、10.12 μg·mL-1的羟基喜树碱标准溶液。精密量取槲皮素储备液,加甲醇稀释为0.51、1.02、2.04、3.06、4.08、5.1、7.65、10.2 μg·mL-1的 槲皮素标准溶液,按照2.2色谱条件进样,测定。以药物浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制线性回归方程。羟基喜树碱的线性回归方程为:Y=81 268X-10 761(R2=0.999 9),线性范围为0.506～10.12 μg·mL-1;槲皮素的线性回归方程为:Y=67 343X-8 960.3(R2=0.999 9),线性范围为0.51～10.2 μg·mL-1。由R值可知,羟基喜树碱和槲皮素在线性范围内,色谱峰面积与药物浓度均有很好的线性关系。

2.4 专属性考察

分别对空白溶剂、羟基喜树碱及槲皮素标准品、样品按照2.2色谱条件进行进样。

在实验选定的色谱条件下,羟基喜树碱A 保留时间t=6.985 min,槲皮素保留时间t=8.879 min,在374 nm 波长处两者峰型较好,并且羟基喜树碱和槲皮素可以很好的分离。空白溶剂对羟基喜树碱以及槲皮素的测定无干扰。可以说明该方法专属性良好,能够满足分析方法的要求。

2.5 精密度试验

分别取10.12 μg·mL-1羟基喜树碱标准溶液,和10.2 μg·mL-1槲皮素标准溶液各6份。当天进行测定,带入标准曲线,计算其浓度的RSD 值,考察日内精密度;隔天再次对标准溶液进行测定,带入标准曲线,计算其浓度的RSD 值,考察日间精密度。精密度试验结果见表1。日内和日间精密度得RSD值均小于1.16%,说明该方法具有良好的精密度,能够满足样品分析学的要求。

表1 日内与日间精密度的结果(n=6)

2.6 回收率试验

回收率试验主要从方法回收率和加样回收率两个方面进行考察。分别取高、中、低3个不同浓度的羟基喜树碱和槲皮素标准品溶液,根据2.2色谱条件进样测定,考察其方法回收率。精密称取空白材料适量,然后按照制剂含量的80%、100%、120%,分别加入适量羟基喜树碱和槲皮素原料药,用甲醇稀释定容并摇匀,进样测定,考察加样回收率。结果见表2。

表2 不同浓度方法回收率测定结果(n=3)

由表2可知,羟基喜树碱和槲皮素在低、中、高3种浓度的标准溶液方法回收率均在98.63%～100.54%之间,RSD 值小于0.32%,表明该方法回收率较好。加样回收率进行考察,结果见表3及表4。其回收率在98.59%～101.89%之间,RSD 值均小于1.73%,说明该方法加样回收率较好。

表3 羟基喜树碱加样回收率结果(n=3)

表4 槲皮素加样回收率结果(n=3)

3 讨论

在抗肿瘤治疗中,为了缓解耐药性的问题,联合用药成为当下的热点。一方面可以缓解药物的耐药性,另一方面可以在降低毒副作用的同时提高药物的治疗效果。但是,联合用药样品的含量测定需要同时兼顾两种药品。而建立一种方便、简单、准确度较高的测定方法,可以更好地推进后续实验的开展。

本研究以羟基喜树碱和槲皮素作为模型药物,制备成纳米混悬剂,使其用于抗肿瘤的治疗。采用高效液相色谱法建立纳米混悬剂中羟基喜树碱和槲皮素的含量测定方法。对色谱条件进行选择,羟基喜树碱是一类色氨酸-萜稀类生物碱,色谱法容易出现拖尾现象,最终确定流动相使用甲醇-水(60∶40)的比例时,可以较好地改善拖尾现象。

在线性范围内建立的两条标准曲线有较好的线性关系,对其方法专属性、精密度、回收率进行考察,结果表明,建立的含量测定方法较简便、专属性较好、可靠、准确度较高,可以用作纳米混悬剂中羟基喜树碱和槲皮素的含量测定。