3例新型冠状病毒肺炎出院患者病毒核酸检测复阳原因探讨

秦维超，孙贵银，李 峰，袁 进，张运洪，邹静波，陈 文

(重庆市江津区中心医院：1.医学检验科；2.院长办公室；3.感染科，重庆 402260；4.重庆市永川区疾病预防控制中心，重庆 402160；5.重庆市江津区疾病预防控制中心，重庆 402260)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一种急性感染性肺炎，是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起，可对公民生命健康造成严重危害的传染性疾病[1-3]。采用实时荧光定量RT-PCR 检测SARS-CoV-2核酸，开放读码框1ab(ORF1ab)和核衣壳蛋白N基因是主要的检测靶点[4]。COVID-19患者咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、外周血、粪便等标本可用于检测SARS-CoV-2核酸[5]。其中，检测出SARS-CoV-2核酸阳性是临床确诊COVID-19的依据，连续两次病毒核酸检测阴性是患者出院的标准之一[6]。病毒核酸检测具有快速、早期、灵敏、特异等优势，但检测结果的准确性还受到标本类型与质量、设备试剂性能、实验操作以及不同疾病阶段等因素影响[7]。

SARS-CoV-2核酸阳性是COVID-19病例确诊的“金标准”[8]，而核酸检测方法由于受采样部位、采样手法等多种因素的影响，也出现了一些假阴性的结果。随着疫情的逐步控制，治愈出院患者也逐步增多，与此同时，也出现了出院患者复检SARS-CoV-2核酸阳性的报道。LAN等[9]报道了武汉大学中南医院COVID-19患者出院后核酸检测复阳病例。重庆地区也出现了少数上述情况。本文回顾性分析了江津区中心医院(以下简称“本院”)3例COVID-19患者在疾病初期确诊、治疗出院和转诊隔离过程中，3家医疗机构实验室核酸检测结果情况及诊疗转归流程，分析患者体内SARS-CoV-2排出时间，探讨核酸检测假阴性影响因素和疾病治疗过程中SARS-CoV-2排出时间使出院患者核酸检测结果复阳的可能原因。

1 病例资料

病例1，男，68岁。旅居史：2020年1月22日从湖北回重庆。发病： 1月31日，患者无明显诱因出现发热于本院就诊。确诊治疗：2月4日江津区疾病预防控制中心(以下简称“疾控中心”)检测咽拭子SARS-CoV-2核酸结果为阳性，诊断为COVID-19普通型；2月5日转入重庆医科大学附属永川医院(以下简称“定点医院”)进一步隔离治疗，采用干扰素a-2b注射液雾化，阿比朵尔、克力芝、中药制剂抗病毒治疗。出院：经治疗后患者连续11 d无发热，2月15、16日连续两次(间隔24 h)核酸检测阴性，经专家会诊，符合出院患者标准出院。转诊隔离：2月17日出院后转入本院隔离病区进行医学隔离观察、治疗。复阳：2月18日，本院取患者咽拭子进行SARS-CoV-2核酸检测，结果为阳性，19日咽拭子病毒核酸复检再次阳性。给予阿比朵尔、左氧氟沙星、连花清瘟治疗。第2次出院：2月21、23、25、29日取咽拭子检测SARS-CoV-2核酸结果为阴性，经专家组讨论后予以出院。

病例2，男，56岁。接触史：2020年1月16日与武汉相关人员接触。发病：1月27日发热(最高38.3 ℃)，于本院就诊。确诊治疗：1月29日疾控中心检测咽拭子SARS-CoV-2核酸阳性，结合临床CT影像，诊断为COVID-19；1月30日转入定点医院住院治疗。出院：经抗病毒治疗后连续5 d无发热，2月4、5日连续2次咽拭子病毒核酸检测(间隔24 h以上)结果阴性，专家会诊后，符合出院标准出院。转诊隔离：2月7日转入本院隔离病区进行医学隔离观察。复阳：2月8日咽拭子核酸检测结果为阳性，2月15、16日再次采集咽拭子，结果均为阳性。予以连花清瘟抗病毒等治疗。第2次出院：分别于2月19、21、23、25日取鼻咽拭子行SARS-CoV-2核酸检测结果为阴性，经专家组讨论后予以出院。

病例3：男，37岁。旅居史：2020年1月12日从武汉回重庆。发病：1月16日，患者不明原因出现发热、恶心、腹泻，1月21日于本院就诊。确诊治疗：1月24日疾控中心取鼻咽拭子核酸检测阳性，诊断为COVID-19。1月27日转入定点医院进一步治疗。出院：经干扰素雾化、洛匹那韦利托那韦片等抗病毒治疗，2月12、13日两次核酸检测呈阴性，经专家会诊后，符合出院标准出院。转诊隔离：2月14日转入本院隔离病区继续进行医学观察隔离治疗。复阳：2月16日，本院采集鼻咽拭子核酸检测为阳性，17日再次采样核酸检测结果均为阳性。本院予以连花清瘟抗病毒等治疗。第2次出院：分别于2月19、21、23、25日取咽拭子行SARS-CoV-2核酸检测结果为阴性。经专家组讨论后予以出院。

2 实验室病毒核酸检测情况分析

3例COVID-19患者在诊疗过程中进行了多次核酸检测，分别选取硕世生物科技股份有限公司(以下简称“硕世”)SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(双重荧光 PCR法，批号20200108)，中山大学达安基因股份有限公司(以下简称“达安”) SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(荧光PCR法，批号2020003)和湖南圣湘生物科技有限公司(以下简称“圣湘”)SARS-CoV-2核酸快速检测试剂盒(PCR荧光探针法，批号2020003)，见表1。

表1 患者在确诊、治疗出院和出院后隔离过程中SARS-CoV-2核酸检测试剂基本情况和技术指标

从核酸检测结果分析可以看出，3例患者在疾控中心确诊时核酸ORF1ab和N基因荧光通道Ct值均较低，双基因阳性明显；出院时两次核酸检测阴性；出院后在本院隔离观察时检测核酸ORF1ab和N基因的Ct值均较高，结果呈双基因弱阳性。病例1、2、3的ORF1ab单基因Ct值达39.81、40.26和41.12，病例2、3的ORF1ab基因Ct值大于相应核酸提取试剂的临界Ct值40，但是分析荧光扩增曲线有明显的尾部抬高，说明标本细胞病毒载量已经很低，呈弱阳性检测结果，见表2。

表2 患者在不同时间不同核酸检测机构的核酸检测情况(Ct值)

3 讨 论

本文通过回顾性分析本院3例COVID-19患者在疾病初期确诊、治疗出院和转诊隔离过程中，分别对3家医疗机构实验室核酸检测结果情况及诊疗转归流程进行分析，以下将探讨核酸检测假阴性影响因素和疾病治疗过程中SARS-CoV-2排毒时间使出院患者核酸检测结果复阳的可能原因。

3.1采集标本病毒载量低 采集标本时要符合以下两个标准：(1)要采集到含病毒的细胞标本；(2)被感染者的细胞中有达到检测限的病毒载量。如果标本采集不规范，不能满足以上两个条件，将导致核酸检测假阴性，可能造成出院患者核酸复阳情况发生。

当机体被病毒感染后，病毒首先通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒载量有所不同，是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同，所以不同时间范围和不同的采样部位可能意味着不同的核酸含量[10]。发病初期采集标本时，病毒载量大的患者“取一次就阳性一次”。对于治疗康复期的患者，其体内的病毒载量处于临界点，采集到含有一定病毒载量的细胞标本比较困难。

文中3例患者核酸检测结果分析显示，疾病发病初期确诊阶段，病毒载量大，病毒标本采集比较容易，故病毒核酸ORF1ab和N基因荧光通道Ct值均较低，呈双基因阳性；在疾病治疗隔离期，标本中病毒载量低，检测核酸ORF1ab和N基因的Ct值均较高，其中病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值达39.81、40.26和41.12，表明出院后患者的病毒核酸检测呈弱阳性，病毒载量低。如果患者在出院时标本采集不规范，并未采集到含有一定病毒载量的细胞，导致核酸检测假阴性。因此，出院病例核酸复阳的原因极大可能因为标本采集不合格，而造成患者病毒核酸检测结果呈假阴性。

本院对出院隔离患者进行了多次核酸检测，发现采集到深部咽拭子时能发现肉眼可见的带血标本，细胞量大，利于提高阳性率；并且本院实行多部位采集、多样本混合检测，一次性采集2份鼻咽拭子和2份口咽拭子标本，也利于提高阳性率。

同时，加强培训，优化和规范标本采集方法，可提高核酸检测阳性率。疾病初期采集鼻咽拭子等上呼吸道标本，治愈康复期最好采集深部咳痰或者肺泡灌洗液等下呼吸道标本；规范采集的操作方法，掌握刮取标本位置、停留时间和力度等采集技巧也有利于提高阳性率。

3.2核酸检测试剂灵敏度低 核酸检测体外诊断试剂的可靠性非常重要，检测的病毒核酸区域的选择极为关键。为了提高检测的灵敏度，多数厂家选择病毒核酸序列中两个或两个以上的区域进行检测。但是每种试剂都有检测灵敏度的下限，因此，对患者进行咽拭子采样时，病毒载量达不到检测下限的时候，结果可能会呈现假阴性。郭元元等[11]也对6种国产SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测性能进行了比较与分析，其结果显示，呈弱阳性结果的患者标本可能不易检出，各试剂的结果存在一定的差异。

从本院3例患者核酸检测结果分析可见，疾病发病初期确诊时体内病毒含量高，检测病毒核酸ORF1ab和N基因荧光通道Ct值均较低，核酸试剂阳性检出率高；而在患者出院后康复过程中，患者病毒量低，检测核酸ORF1ab和N基因的Ct值均较高，呈弱阳性。病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值达39.81、40.26和41.12，其病毒核酸ORF1ab基因Ct值达接近或者大于了核酸提取试剂所要求的临界结果判断值40，但是荧光扩增曲线有明显的尾部抬高，呈弱阳性检测结果。此外，本院在对3例患者隔离期弱阳性标本进行多种核酸检测试剂比对试验中发现，存在一定比例标本单个靶区域阳性的结果，说明试剂对标本不同区域的灵敏度确实存在差异，尤其在对弱阳性标本检测时，不同试剂的不同单基因阳性结果表现更为明显。因此，如果核酸检测试剂的灵敏度较低将会造成患者弱阳性标本的核酸检测结果呈假阴性。

3例患者在确诊、治疗、隔离观察3个阶段进行了多次核酸检测，均采用了不同的核酸提取试剂和核酸检测试剂。由于试剂厂家研发时间短，各种试剂灵敏度不同，为200～1 000 copy/mL；在疫情特殊时期，也没有使用已知临床标本进行必要的性能确认，当标本中病毒载量低于检测下限时，灵敏度低的核酸检测试剂就无法检出病毒。沈利华等[12]对3种国产SARS-CoV-2核酸检测试剂进行临床效能评估发现，不同核酸检测试剂和核酸提取方法的阳性符合率和一致性均有较大的差异。

3.3病毒核酸检测结果复阳与疾病病程发展和临床治疗用药具有一定关系 SARS-CoV-2感染机体后，两周内产生抗体，因此，传播风险较低，这种抗体对人体有保护作用，对病毒的清除也会持续进行。ZHOU等[13]研究了SARS-CoV-2的排毒时间，指出137例出院患者的中位排毒时间为20 d，最短8 d，最长可达37 d。肺炎是潜伏期较长的疾病，部分COVID-19复阳病例是处于炎症在吸收过程中，不是临床的痊愈，因此，可能存在产生间歇性排毒现象，但需要大样本量、多中心研究进行进一步的证实。

3例患者均使用了抗病毒药物等治疗，从患者临床表现和影像CT结果看，清除病毒治疗有效，两次核酸检测阴性后，从定点医院出院，符合诊疗规范。病例1、2、3从出院到核酸检测结果复阳时间为2～7 d，其中病例1、2、3从确诊病毒核酸检测结果阳性到隔离观察时病毒核酸检测结果为阴性的时间分别是第18、22、27天，表明SARS-CoV-2在患者体内存留时间不同，提示患者排毒时间可能与疾病病程发展有关，并且通过对病毒核酸ORF1ab和N基因荧光通道Ct值比较发现，随着治疗时间延长，体内排毒量可能逐渐降低。因此COVID-19患者治疗后期病毒排毒量和排毒时间的不确定，是否为患者核酸复阳的原因均需有待进一步研究证实。

本院对3例患者在隔离期检测核酸复阳后连续监测过程中发现，病例1、2、3在最后一次核酸阳性2 d之后再行多次核酸检测均为阴性。表明体内病毒在逐渐清除可以达到完全康复。

综上所述，COVID-19的诊断和治疗是一个综合临床思辨的过程，要充分认识到SARS-CoV-2核酸检测的影响因素较多，反复多次的核酸检测具有一定必要性，同时重视提高检测试剂的灵敏度，加强质量控制和规范标本的采集，从而提高诊断的阳性率。COVID-19治疗出院患者SARS-CoV-2核酸检测结果复阳时，一种情况是疾病没有完全治愈，临床症状缓解，但是体内还存在少量的病毒，可能因为标本采集不规范和各种试剂盒核酸检测灵敏度不同，造成了患者体内核酸检测结果呈假阴性，导致COVID-19治疗出院后的核酸检测结果复阳；另一方面可能是患者体内SARS-CoV-2排毒时间不规律和不确定导致出院后病毒核酸检测结果复阳，还有待进一步证实。为了防止出院后患者核酸检测结果复阳，相关机构需要制订更加严格的出院标准，可以增加SARS-CoV-2核酸检测的次数，同时，增加对SARS-CoV-2特异性抗原、抗体检测[14]，综合判断COVID-19患者诊断标准和出院标准，减少感染风险。