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脓毒症患儿外周血单个核细胞中微小RNA-466和GPR18 mRNA的表达及诊断价值

2020-11-03董国庆

国际检验医学杂志 2020年20期
关键词:脓毒症外周血计数

赵 杰,董国庆

(1.广州医科大学2015级儿科,广东广州 511436;2.中山大学附属第八医院儿科,广东深圳 518033;3.广东省深圳市妇幼保健院儿科,广东深圳 518028)

脓毒症是引起患儿死亡的常见疾病,其发展迅速,可引起休克等并发症[1-4],脓毒症的诊断常依赖患儿临床表现和白细胞(WBC)计数等检查,但其诊断效能较低,不具有特异性,探索新的诊断标志物对提高脓毒症诊治水平具有重要意义。微小RNA(miRNA)广泛存在于人体组织内,可调控细胞生长及肿瘤进展等过程,被认为是炎症和癌症潜在的诊断分子标志物和治疗靶标[5]。有研究显示,在脂多糖诱导小鼠的支气管肺泡中发现巨噬细胞的miRNA-466表达增加[6]。G蛋白偶联受体18(GPR18)由位于13q32.3上GPR基因编码,是相对分子质量约为36×103的蛋白,在大肠杆菌诱导的小鼠炎症模型循环中单核细胞和巨噬细胞中GPR18表达增加,且参与控制炎症信号通路激活[7]。本研究检测脓毒症患儿外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量,并探讨其对脓毒症患儿的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年10月至2019年6月在中山大学附属第八医院(以下简称“本院”)儿科诊断和接受治疗的脓毒症患儿90例为病例组,其中男55例、女35例,年龄4个月至5岁、平均(2.19±0.71)岁。患儿入院时符合儿童脓毒症诊断标准[8],符合以下2项或2项以上指标时确诊:(1)体温>38 ℃或<36 ℃;(2)心率>90次/分钟;(3)呼吸频率>20次/分钟或CO2分压[Pa(CO2)]<32 mm Hg;(4)外周血WBC计数>12.0×109/L或<4.0×109/L,或未成熟粒细胞>10%。排除标准:(1)具有严重药物过敏史者;(2)先天性免疫功能缺陷者;(3)治疗配合不佳者。选取同期在本院儿科保健中心体检的健康儿童60例为对照组,其中男35例、女25例,年龄3个月至5岁、平均(2.18±0.73)岁。两组性别构成、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准同意实施。

1.2方法

1.2.1序贯器官衰竭评分(SOFA评分) 脓毒症患儿于确诊后行全身性感染相关性SOFA评分[9],包括呼吸系统、血液系统、肝脏、心血管系统、中枢神经系统及肾脏共6个系统评估,每项评分为0~4分,总分为0~24分。分数越高,预后越差。

1.2.2WBC和C反应蛋白(CRP)的检测 采用乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集病例组于确诊后12 h内及对照组静脉血各5 mL,储存待测,送本院检验科行全血分析和CRP水平检测。

1.2.3两组外周血单个核细胞miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量的检测 取待测抗凝血,采用密度梯度法分离单个核细胞,采用Trizol总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取两组血液标本总RNA,然后采用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)逆转录,以U6小核或β-actin为内参,按荧光定量PCR试剂盒说明书在LightCycler 480荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪上行PCR。引物序列如下,miRNA-466引物:上游,5′-GCC CGT AAC AGT CTA CAG CCA T-3′;下游,5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′。U6引物:上游,5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′;下游,5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。GPR18引物:上游,5′-ACA TCC AAA ATC TTG ATC AGT TA-3′;下游,5′-AGG ACA GAC TTT CAA AAT G-TTT-3′。β-actin引物:上游,5′-AGC GAG CAT CC-CCC AAA GTT-3′;下游,5′-GGG CAC GAA G-GCT CAT CAT T-3′。PCR反应条件:95 ℃ 1 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,74 ℃ 30 s,连续循环38次。算法采用2-ΔΔCt法,计算单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1两组WBC、CRP、miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量的比较 病例组WBC和CRP水平均显著高于对照组(P<0.05);病例组外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组WBC、CRP、miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量的比较

2.2WBC计数和CRP水平与SOFA评分的相关性 病例组WBC计数和SOFA评分无相关性(r=0.238,P=0.543);脓毒症患儿CRP水平和SOFA评分呈正相关(r=0.472,P<0.01)。

2.3miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量与SOFA评分的关系 脓毒症患儿单个核细胞中miRNA-466相对表达量和SOFA评分呈正相关(r=0.489,P<0.001);脓毒症患儿外周血单个核细胞中GPR18 mRNA相对表达量和SOFA评分呈正相关(r=0.507,P<0.001)。

2.4miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量的关系 病例组单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.618,P<0.001)。

2.5相关指标对患儿脓毒症的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,当CRP截断值为131.52 μg/mL时,其诊断脓毒症的曲线下面积(AUC)为0.758(95%CI:0.669~0.817),灵敏度为68.0%,特异度为71.3%;当miRNA-466相对表达量截断值为1.67时,其诊断脓毒症的AUC为0.901(95%CI:0.813~0.969),灵敏度为84.5%,特异度为87.9%;外周血单个核细胞中GPR18 mRNA相对表达量截断值为1.89时,其诊断脓毒症的AUC为0.858(95%CI:0.761~0.917),灵敏度为71.0%,特异度为92.3%;当miRNA-466和GPR18mRNA联合检测时,其诊断脓毒症的AUC为0.947(95%CI:0.898~0.981),灵敏度为90.9%,特异度为93.9%。

3 讨 论

脓毒症是各种因素引起的全身炎性反应,为儿科最常见的危重症[10]。近年来,我国儿童脓毒症发病率呈逐年升高趋势,且临床治愈率逐年提高[11]。尽管如此,鉴于儿童脓毒症临床表现多样、病情发展迅速、病死率高的特点,急切需要对儿童脓毒症进行早期、及时地诊断[12-13]。

尽管脓毒症具体发病机制尚未完全清楚,但脓毒症病情进展迅速,常导致全身多个器官功能障碍,甚至死亡,与机体炎性反应及免疫功能紊乱密切相关[14]。因此,外周血中与炎症和免疫反应相关的非特异标志物,如WBC计数和CRP水平,常用于临床诊断和评估脓毒症患者的预后[15-16],但其缺乏特异性,诊断效能不佳。miRNA是多种疾病诊断的标志物和潜在治疗靶标[17-18]。有研究发现,多种miRNA及其长链非编码RNA参与调控炎性反应及免疫过程,对脓毒症诊断及预后具有重要价值[19-20]。

GPR18在人类白细胞中广泛表达,尤其在单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中表达水平较高,是参与巨噬细胞吞噬和自噬过程的重要分子标志物[7,21]。本研究发现,病例组患儿外周血中WBC和CRP水平显著高于对照组(P<0.05)。脓毒症患儿机体处于炎症激活状态,导致与炎症相关的非特异性蛋白CRP水平增加[22]。同时,本研究结果显示,脓毒症患儿外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)。ZHANG等[21]研究显示,RT-PCR和流式细胞仪检测菌血症且在ICU接受治疗的患者WBC中GPR18 mRNA 和蛋白表达均增加。尽管感染期间miRNA-466和GPR18 mRNA 增加的机制尚不清楚,但是其可能与机体在感染和应激状态下免疫系统激活、炎症级联反应,以及巨噬细胞吞噬和自噬密切相关[23]。

Pearson相关分析显示,WBC计数与SOFA评分无相关性,提示WBC计数可能受到多种因素影响,与脓毒症患者病情严重程度缺乏关联性,其原因可能为WBC计数虽为炎症指标,但并不能反映脓毒症的严重程度[24]。本研究发现,CRP水平、外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量均与患儿SOFA评分呈正相关(P<0.05),同时miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量呈正相关(P<0.05),说明CRP水平、外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA相对表达量可用于评估脓毒症病情严重程度。

ROC曲线分析结果显示,CRP诊断脓毒症患儿的AUC为0.758,外周血单个核细胞中miRNA-466相对表达量诊断脓毒症的AUC为0.901,外周血单个核细胞中GPR18 mRNA相对表达量诊断脓毒症的AUC为0.858,miRNA-466和GPR18 mRNA联合检测时,AUC为0.947,说明外周血中性粒细胞miRNA-466的诊断效能优于GPR18 mRNA和CRP水平,并且联合检测miRNA-466及GPR18 mRNA时,AUC为0.947,其灵敏度和特异度可提高至90.9%和93.9%,因此,临床上联合检测miRNA-466及GPR18 mRNA对脓毒症诊断价值更高。

本研究为单中心研究,纳入的病例数较少,尚需要大样本多中心前瞻性研究来进一步证实;其次,本研究未探讨在脓毒症患儿治疗过程中CRP、miRNA-466和GPR18mRNA表达变化情况;最后,脓毒症患儿治疗过程中不同的用药和治疗方法是否影响中性粒细胞miRNA-466和GPR18 mRNA表达尚需要进一步研究。

4 结 论

综上所述,脓毒症患儿外周血单个核细胞中miRNA-466和GPR18 mRNA表达水平增加,且与患儿SOFA评分相关,联合检测miRNA-466及GPR18 mRNA对患儿脓毒症具有较高的诊断价值。

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