改良支原体培养鉴定方法的探索*

蔡高台，程灿灿，张洪荣，李榕娇，周彩容，陈宪楷，尹小毛

(1.南方医科大学第五附属医院检验科，广东广州 510900；2.广州市番禺区中心医院检验科，广东广州 515400;3.广州医科大学附属顺德医院检验科，广东佛山 528315)

支原体是常见的泌尿生殖道病原体，主要包括解脲脲原体(Uu)、微小脲原体(Up)、人型支原体(Mh)和生殖支原体(Mg)等，可引起成人和婴儿的多种感染[1]。除了Mg外，其他支原体的实验室诊断主要通过培养来实现[2]。目前，有许多商业诊断试剂盒用于支原体的培养、鉴定和药物敏感性试验，其中支原体IST2试剂盒被广泛用于Mh和脲原体(本文将Uu和Up统称为脲原体)的检测。采用IST2试剂盒对黏液标本进行培养时，包裹在黏液中的支原体很难被释放，将导致支原体在液体培养基中分布不均，使后续的菌落计数和药物敏感性试验结果出现偏差。本研究将通过延长标本洗脱后放置时间来解决这一问题。具体内容如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年11—12月在妇科门诊就诊或住院的患者阴道分泌物标本32份，均为带有浓稠黏液或透明黏液的标本。

1.2仪器与试剂 FAST 96-WELL型PCR扩增仪购自美国Applied Biosystems公司，凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker 1000均购自TaKaRa公司，DNA提取液购自中山大学达安基因股份有限公司，支原体培养、鉴定、药物敏感性一体化试剂盒购自法国生物梅里埃公司。引物合成及测序服务均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3方法

1.3.1培养及分组 按照试剂盒说明书进行标本的接种及结果判断。对照组：支原体培养基溶解后，将阴道分泌物拭子在培养基中进行洗脱，然后取培养液加入检测试条的反应孔中(每孔50 μL)，用液体石蜡封闭后直接放入温箱中孵育，剩余液体培养物也放入温箱中孵育。试验组：4 h后取出剩余液体培养物并再次混匀，然后取一张新的检测试条，将培养液加入检测试条的反应孔中(每孔50 μL)，后续试验步骤同对照组。观察记录两组检测试条在试验结束时的药物敏感性及菌落数差异。

1.3.2脲原体DNA提取 对于药物敏感性有差异的菌株，取其液体培养物上清液400 μL，12 000 r/min离心5 min后弃上清液，加灭菌生理盐水1 mL，充分混匀后12 000 r/min离心5 min并弃上清液；沉淀中加入50 μL DNA提取液，充分混匀后100 ℃温浴10 min，冷却后12 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.3.3PCR扩增及测序 以提取的脲原体DNA为模板，采用PCR扩增相关耐药基因并进行测序分析。所涉及的引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，退火30 s(各片段温度参考表1)，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将PCR产物送公司进行测序。

表1 引物列表

1.4统计学处理 参照已报道的支原体标准株Up ATCC 700970(GenBank序列号：AF222894)和Uu ATCC 33699(GenBank序列号：CP001184)的gyrA、gyrB、parC、parE,23S rRNA基因、L22、L4蛋白基因，分析耐药菌株的各基因序列的突变情况并进行氨基酸预测，tetM基因分析为检测PCR产物是否有扩增目标条带。分析有药物敏感性改变的菌株是否有耐药基因突变。

2 结 果

2.1菌落数差异 根据实验设计入组标准，符合条件的标本共32份，其中出现菌落数差异16份，存在药物敏感性差异12份，其中3份标本同时出现菌落数差异及药物敏感性差异。见表2。

表2 两组中菌落数差异情况

2.2药物敏感性差异 在两组药物敏感性比较中，出现差异的有12份，具体差异情况见表3。

表3 两组中12份标本对不同药物的敏感性差异

2.3相关耐药基因检测及突变情况 在出现药物敏感性差异的菌株中，选择8株菌进行了相关耐药基因检测。其中1号菌只检测tetM基因，电泳结果发现确实存在该基因。其余7株菌的检测情况见表4。

表4 耐药相关基因在药物敏感性差异菌株中的突变情况

3 讨 论

脲原体和Mh是泌尿生殖道最常见的两种病原体，其感染可导致女性宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎等，男性尿道炎、慢性前列腺炎、附睾炎等。据报道支原体的感染以单纯的脲原体感染较多[5]，感染人群以女性为主[6-7]。支原体“金标准”检测方法为液体培养与固体培养相结合的方法[8]，但由于该方法耗时长、步骤多而较难满足临床需求。目前临床较常用的检测方法是液体培养鉴定加药物敏感性试验，但是该方法常常因黏液影响而检测不准确，改进培养方法有助于提高支原体培养的阳性率和药物敏感性试验的准确性。

在本研究中，试验组与对照组存在菌落数差异比例达到50%(16/32)，试验方法明显提高了支原体的检出率。在相应的药敏试验中也出现了差异，有11株出现了耐药等级的升高，而仅有1株是耐药等级的降低，这也说明可能较浓稠的黏液在液体培养基中分配不均，导致结果不稳定。

本研究对药物敏感性试验结果有差异的菌株进行了耐药基因检测，并发现了耐药突变位点。23S rRNA基因及核糖体蛋白L22及L4基因的突变，是目前造成大环内酯类耐药的主要原因[9]。本研究中L22蛋白的基因突变位点较多，其中G361T(A121S)和C422T(T141I)是两个较典型的突变多态性位点，也有研究报道G196A(D66N)为突变多态性位点[10]。通常认为这种氨基酸多态性与耐药无关。但A406G(I136V)位点并未见报道过，是否与大环内酯类耐药相关也无临床及实验证据，尚需进一步研究。

旋转酶是由gyrA和gyrB基因编码，拓扑异构酶Ⅳ由parC和parE基因编码。研究显示，4个基因的喹诺酮耐药决定区域(QRDRs)突变与支原体对该类药物的耐药有关[11]。本研究检测了4株脲原体上述4个基因中的QRDRs突变情况。其中parC基因的 C248T(S83L)突变，可能与左氧氟沙星的耐药有关[12]。另外C398T位点突变造成133位氨基酸由P变成L，该位点暂未发现有报道与喹诺酮类相关。脲原体耐药机制复杂，除QRDRs基因突变外，还有其他相关耐药机制如形成生物被膜等[13]。因此，其余菌株未检测到喹诺酮相关突变耐药基因也可能对喹诺酮类药物耐药。

支原体对四环素类药物耐药与tetM基因携带及表达相关[14]。本研究检测的1号菌株携带tetM基因，这极有可能是其对四环素类药物不敏感的原因。据报道，携带tetM蛋白的Mh表现为对四环素的不同程度的耐药，而对多西环素则可以表现为敏感[15]。关于脲原体的研究则表明，tetM蛋白使其对耐四环素类药物的贡献并不确定[3]。在大多数的脲原体调查研究中，其对四环素类药物相对较敏感，tetM基因的检出并不多见。但tetM基因通常位于脲原体的染色体可转移性元件上，快速传播的风险比较高，因此更应受到重视。

4 结 论

本研究对支原体鉴定药敏试剂盒的培养方法作了部分修改，以便培养带有黏液的标本时得到更准确的结果。结果发现支原体的阳性率有所提高，药物敏感性试验结果也发生了变化，但其结果的变化是否准确反映菌种耐药分子特征尚不能确定。对耐药基因的检测则发现parC基因的 C398T(P133L)和L22基因的A406G (I136V)两个突变，其耐药相关性尚需进一步研究。