微柱凝胶法检测血液中两种抗菌药物诱导形成药物性抗体的研究*

2020-11-03赵昕亚

国际检验医学杂志 2020年20期

董林，包进，赵昕亚，徐菲

(南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院输血科，江苏南京 210006)

药物诱导的免疫性溶血性贫血(DIIHA)是一种由IgG或者IgM介导细胞毒性抗体的Ⅱ型变态反应[1]，主要的发病机制是产生相应的抗药物抗体，随着药物再次使用可能导致溶血的发生，患者使用抗菌药物后发生此种不良反应较多[2]。目前，有关药物性抗体的研究报道较少，且检验科和输血科未开展对药物性抗体的检测，因此，患者发生溶血后，分析溶血发生的原因具有重要的意义。头孢哌酮钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠是临床上较为常用的β-内酰胺酶抑制剂复合抗菌药物，为了解药物性抗体形成的可能性，本文收集188例在本院住院期间使用头孢哌酮钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠治疗的患者血液标本，应用药物包被红细胞的方法，通过微柱凝胶抗人球蛋白检测技术检测药物性抗体存在的可能性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选择本院2019年4-9月收治的采用注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠药物治疗的患者188例为研究对象，其中男102例，女86例；年龄34～83岁，平均(65.41±10.28)岁。纳入标准：使用头孢哌酮钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠治疗3 d以上；使用药物后标本中血红蛋白水平低于使用药物之前；使用药物之前不规则抗体、直接抗人球蛋白试验(DAT)、药物性抗体均为阴性；住院前均未接受抗菌药物的治疗。188例患者中使用头孢哌酮钠舒巴坦钠治疗112例，使用哌拉西林钠舒巴坦钠治疗76例。

1.2仪器与试剂

1.2.1试剂微柱凝胶抗人球蛋白检测卡、不规则抗体筛检细胞(人红细胞，长春博迅生物生物技术有限责任公司)；注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(辉瑞制药有限公司)；注射用哌拉西林钠舒巴坦钠(湘北威尔曼制药股份有限公司)；头孢哌酮钠舒巴坦钠抗体阴性和阳性对照检测试剂、哌拉西林钠舒巴坦钠抗体阴性和阳性对照检测试剂(江苏中济万泰生物医药有限公司)；O型红细胞(南京市血液中心健康献血者血源)；0.9%氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司)；巴比妥缓冲液、磷酸盐(PBS)缓冲液(南京信帆生物技术有限公司)。

1.2.2仪器标本离心机(北京白洋医疗器械公司)；微柱凝胶卡专用离心机、孵育器(长春博研科学仪器有限责任公司)。

1.3方法采集所有研究对象的空腹静脉血3 mL，使用EDTA-K2抗凝。

1.3.1DAT 浓缩红细胞用0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为0.8%的红细胞悬液，取50 μL加入含有抗球蛋白试剂的微柱凝胶卡中，采用专用离心机离心后判断DAT结果，对DAT阴性的标本进行血浆中药物性抗体的检测，对DAT阳性的标本检测血浆和放散液中的药物性抗体。

1.3.2不规则抗体筛查通过间接抗球蛋白试验(IAT)检测不规则抗体：将50 μL血浆标本和50 μL不规则抗体筛检细胞加入微柱凝胶抗球蛋白检测卡中，37 ℃孵育15 min，900 r/min离心2 min，1 500 r/min离心3 min，读取结果。

1.3.3放散试验收集所有DAT阳性患者的标本，吸取100 μL浓缩红细胞，采用生理盐水洗涤3次，加入等体积的生理盐水，放入56 ℃震荡水浴箱10 min，迅速离心分离放散液。

1.3.4两种舒巴坦类抗菌药物包被红细胞的制备将药物0.1 g溶于0.25 mL pH为9.6～9.8的巴比妥缓冲液中，同时加入洗涤后的O型红细胞170 μL；另取试管加入同样的洗涤后O型红细胞和巴比妥缓冲液。室温孵育1 h，其间反复混匀数次，之后用PBS缓冲液洗涤红细胞3次，并配置成5%的溶液，4 ℃冰箱保存1周。使用前用生理盐水洗涤PBS缓冲液中的O型红细胞后，并用生理盐水稀释成细胞浓度为2%。

1.3.5药物包被红细胞检测抗体检测试剂盒阴性、阳性对照试剂各50 μL与2%的红细胞(药物包被和无药物包被)25 μL混合后加入微柱凝胶卡，37 ℃孵育60 min，900 r/min离心2 min，1 500 r/min离心3 min。用头孢哌酮钠舒巴坦钠抗体以及哌拉西林钠舒巴坦钠抗体阴性和阳性对照检测试剂对药物包被的红细胞进行检测，从而判断包被成功与否。

1.3.6药物性抗体检测用生理盐水洗涤药物包被后的红细胞，并稀释成浓度为2%的溶液。取微柱凝胶抗人球蛋白卡，从左到右标记4个孔，孔中加入相应的血浆/放散液和药物包被红细胞，见表1。37 ℃孵育60 min、900 r/min离心2 min、1 500 r/min离心3 min，判断结果。仅有第1孔加入患者血浆/放散液和药物包被O型红细胞中出现凝集现象，为药物性抗体阳性。

表1 药物性抗体检测的微柱凝胶卡孔中所加入的血浆和红细胞

1.4统计学处理采用SPSS17.0软件对数据进行分析。计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不规则抗体筛查 188例血浆标本不规则抗体筛查结果均为阴性。

2.2DAT检测 188例标本中DAT阳性有36例，其中头孢哌酮钠舒巴坦钠药物使用者23例阳性，哌拉西林钠舒巴坦钠药物使用者13例阳性。

2.3药物包被红细胞检测仅有第3孔加入阳性对照和药物包被红细胞出现凝集现象，为阳性，表示药物包被红细胞成功。其余3孔均无凝集现象，为阴性。见表2。

表2 药物包被红细胞的结果

2.4两种药物性抗体阳性率的比较头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率(31.245%)高于哌拉西林钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率(18.42%)，差异有统计学意义(P<0.05)。而DAT阳性的标本中，头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体阳性率(47.82%)略高于哌拉西林钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率(46.15%)，但差异无统计学意义(P>0.05)；DAT阴性标本中，头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率(26.97%)高于哌拉西林钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率(12.70%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两种药物性抗体的阳性率对比

2.5DAT阳性放散液中不规则抗体、药物性抗体检测 36例DAT阳性标本的放散液中不规则抗体检查结果均为阴性，11例头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体阳性的放散液中药物性抗体检测结果也为阳性，6例哌拉西林钠舒巴坦钠药物抗体阳性的放散液中药物性抗体检测结果也为阳性。

3 讨论

DIIHA是一种较为少见的药物不良反应[3]，它与药物活性无关，主要是由于长时间或者与大量的药物接触造成的[1]。头孢菌素类抗菌药物是临床应用较为广泛的药物之一，约有80%会导致药物性溶血性贫血[4]，其中最为明显的是第2代或者第3代头孢菌素[5]。头孢哌酮是第3代头孢菌素类抗菌药物，通过抑制细菌细胞壁合成发挥抗菌作用，一直以来被广泛应用于临床，其对造血系统的毒性较为明确，主要表现为血小板减少和凝血功能障碍，贫血的报道较为少见[6-7]。王晴[8]认为第3代头孢菌素造成血红蛋白减少的原因为其可能引起骨髓造血功能停滞，马春娅等[9]研究发现患者使用头孢哌酮钠舒巴坦钠后，出现血红蛋白下降、血小板降低、DAT阳性、溶血指标上升等情况，认为其血浆中存在头孢菌素类药物的抗体。TASCH等[10]研究指出，头孢菌素类抗菌药物引起药物性溶血主要是体内存在药物抗体。哌拉西林钠舒巴坦钠是一种青霉素和酶抑制剂的复合制剂，对各种细菌都有较好的抗菌活性，广泛用于重症感染患者的治疗。LEGER等[11]研究发现，73例DIIHA患者中有13例使用了哌拉西林，这13例患者均出现了急性溶血反应，DAT结果也为阳性。LOHIYA等[12]认为哌拉西林诱导贫血的机制可能是由于抗体/半抗原与红细胞膜表面蛋白共价结合后形成半抗原/蛋白复合物，从而导致体内抗体的产生，破坏红细胞从而超过骨髓的代偿能力。LEGER等[11]报道，美国近50%使用哌拉西林的随机住院患者体内可产生哌拉西林药物性抗体，阳子骥等[13]也报道哌拉西林比较容易产生相应的药物性抗体。

微柱凝胶抗人球蛋白检测技术是将间接抗人球蛋白技术和凝胶的分子筛作用结合的一种血清学分析技术，当血清中有IgG或IgM类药物性抗体存在，可以与相应的药物包被红细胞发生反应，在凝胶中抗人IgG抗体的桥连作用下，形成红细胞的凝块，离心后并不能通过凝胶从而沉积在凝胶上端，未凝集的红细胞沉积到凝胶底部[14]，从而可以反映药物性抗体的存在。目前输血科通常运用该技术检测与血型系统相关的意外抗体。本研究中所有血浆标本及DAT阳性标本的放散液中不规则抗体均为阴性，因此，排除检测过程中由于血型相关意外抗体阳性导致假阳性的可能。一直以来DAT阳性的标本被认为和药物性抗体有着较为密切的关系[15]，本研究发现，DAT阳性标本中，头孢哌酮钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠的药物性抗体在血浆和放散液中均有存在；而对于DAT阴性的标本，也发现两种药物相应的药物性抗体，可能原因如下：一是DAT结果阳性可能并不是药物性抗体导致的；二是由于在既往报道中患者均出现了部分临床症状，此时患者已使用抗菌药物进行治疗，从而导致红细胞表面吸附较多的药物性抗体，引起DAT结果阳性。同时，本研究结果显示，头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体以及DAT阴性标本中头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体阳性率均高于哌拉西林钠舒巴坦钠药物性抗体的阳性率，说明头孢哌酮钠舒巴坦钠药物性抗体形成的可能性较大；而在DAT阳性标本中，两者的阳性率相似，均在50%左右，差异无统计学意义(P>0.05)。笔者认为当DAT出现阳性时，患者已经出现临床症状，或者输血科配血过程中已经出现无法相合的情况，此时药物性抗体的产生可能与所用的药物并无关系。