杨梅叶中杨梅素的提取及抗氧化性研究

童天娇， 刘军海， 刘 艳， 曹 瑞， 魏玲玲

(陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000)

杨梅树又名山杨梅、朱红、珠蓉，属于杨梅科常绿乔木，适应性广，易于栽培，适宜在酸性的土壤种植。杨梅树的人工栽培技术已经有2 000多年的历史，中国的浙江、江苏、台湾、福建等地均有分布，在东南亚国家也有分布。杨梅树生长于山坡或山谷森林中，树龄长，可绿化美化环境，具有很高的观赏价值。杨梅果实、杨梅叶、杨梅根、杨梅树皮等均有食用或药用价值。杨梅叶含有黄酮类化学物、原花青素、精油等多种活性成分，具有很高的经济价值。杨梅叶中黄酮类化合物的主要成分为杨梅素，又名杨梅树皮素、杨梅黄酮，是一种多羟基黄酮，具有抗氧化作用，置于空气中易被氧化成绿色[1]。杨梅素主要来源是杨梅科及其他天然植物，因具有多样的医药价值而受到广泛的关注和大量的研究[2-4]。从杨梅树自身的应用价值来看，杨梅颈条、杨梅枝条和杨梅叶均含有杨梅素[5-6]。杨梅叶资源丰富，目前没有得到有效的利用，大量废弃造成资源的浪费。因此，本研究以杨梅叶为原料，采用超声波提取工艺提取杨梅素，在单因素试验基础上通过正交试验优化提取工艺，并考察了杨梅素的抗氧化活性，以期为杨梅素的提取与应用，以及杨梅叶资源的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

杨梅叶，采于浙江余姚市；杨梅素标准品(纯度≥97%)，上海笛柏生物科技有限公司；维生素C片，西安利君制药有限责任公司；DPPH、硫酸亚铁、30%过氧化氢、水杨酸、无水乙醇，均为分析纯。

FW117中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；离心机，北京京立离心机有限公司；722可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司制造；电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；Cary50型紫外可见分光光度计，美国瓦里安；LC-2030液相色谱仪，岛津公司。

1.2 杨梅素的提取与测定方法

1.2.1原料的预处理 杨梅叶经蒸馏水清洗、自然晾干后，于60 ℃烘箱中干燥至质量恒定，然后粉碎机粉碎过425 μm筛，得到杨梅叶粉末，备用。

1.2.2杨梅素的提取 准确称取一定量的杨梅叶粉末于烧杯中，加入一定量的乙醇溶液浸泡0.5 h后，加表面活性剂茶皂素[7]，在超声波[8]提取器中设置一定温度、时间进行提取。提取结束后，冷却至室温，离心，收集离心瓶中的溶液于量筒中，记录其体积(V)，得到杨梅素的提取液，稀释一定的倍数，采用液相色谱仪在检测波长373 nm时测定杨梅素的色谱峰面积，根据标准曲线计算杨梅素质量浓度，按下式计算杨梅素的提取得率。

式中：Y—杨梅素提取得率，%;C—由标准曲线方程计算得到的杨梅素质量浓度，g/L；V—杨梅素提取液的体积，L；N—提取液的稀释倍数；m—称取杨梅叶粉末质量，g。

1.2.3保留时间的确定 准确称取杨梅素标准品20 mg，以体积分数80%的乙醇溶液溶解于100 mL容量瓶。在离心管中取少量杨梅素稀释液，离心机转速3 000 r/min离心10 min后，取一定体积定容至50 mL，用液相色谱仪测定[9]，检测器为UV-Vis,检测波长为373 nm[10]，C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，粒径3.5 μm)，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速0.8 mL/min。杨梅素标准品色谱图见图1(a)，杨梅素提取液色谱图见图1(b)。由图可知，杨梅素的保留时间为2.3 min左右。

图1 杨梅素标准品(a)和提取液(b)的色谱图

1.2.4标准曲线的绘制 准确称取20 mg杨梅素标准品，并用80%乙醇溶液溶解于100 mL容量瓶。于6个25 mL容量瓶分别移取2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0和12.0 mL上述溶液，用80%乙醇溶液稀释定容摇匀静置；分别取少量的稀释液，以1.2.3节方法进行离心操作，在373 nm处分别测定各溶液的色谱峰面积；以杨梅素标准品溶液的质量浓度(g/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在质量浓度0.016～0.096 g/L范围内，得到线性回归方程为：y=455 795.21x-86 988.6，相关系数为0.999 8，说明峰面积与溶液质量浓度之间有良好的线性关系。

1.3 杨梅素的抗氧化性实验

1.3.1DPPH自由基清除率的测定 按文献[11-12]方法，以正交试验所得到的最佳提取工艺提取杨梅素，将杨梅素溶液稀释配制成0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 mg/L系列溶液。以无水乙醇为溶剂，在棕色容量瓶中制备浓度为0.1 mol/L DPPH自由基溶液。将不同质量浓度的杨梅素溶液各取2.0 mL于 10 mL 试管，并加入2.0 mL DPPH自由基溶液，摇匀，反应30 min，在377 nm测量吸光度(Ai)。另取不同质量浓度的杨梅素溶液2.0 mL于10 mL试管中，用2.0 mL无水乙醇代替DPPH自由基溶液，反应30 min，测量吸光度(Aj)。用2.0 mL DPPH自由基溶液和2.0 mL无水乙醇溶液代替杨梅素溶液，摇匀，反应30 min，测量吸光度(A0)作为参比，用相同的实验方法测定VC的抗氧化活性。杨梅素对DPPH·清除率(η)的计算公式为：η=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.3.2OH自由基清除率的测定 参考文献[13-14]方法，将杨梅素稀释成30、 60、 90、 120和150 mg/L 的溶液。取1 mL不同质量浓度的杨梅素稀释液于试管中，各加入1 mL的2.25 mmol/L FeSO4和2.25 mmol/L H2O2至混合液中，静置10 min后，加入1 mL 2.25 mmol/L水杨酸溶液，混合溶液置于黑暗处反应30 min，于377 nm处测定溶液的吸光度(Ai)；使用蒸馏水代替水杨酸溶液，测其吸光度(Aj)；用蒸馏水代替杨梅素溶液，测其吸光度(A0)，通过相同的实验方法测定VC的抗氧化活性。杨梅素对·OH 清除率(η)的计算公式同1.3.1节。

2 结果与讨论

2.1 杨梅素提取的单因素试验

2.1.1液料比 准确称取1.0 g杨梅叶粉末5份，置于5个100 mL烧杯中，以液料比10 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1、 25 ∶1和30 ∶1(mL ∶g，下同)分别加入80%的乙醇溶液，摇匀，浸泡0.5 h之后，加入0.5%(以杨梅叶粉末质量计，下同)表面活性剂茶皂素，设定超声波提取温度60 ℃，提取时间40 min，进行超声波提取。液料比值对提取得率的影响见图2(a)。由图2(a)可以看出，随着液料比值的增加，杨梅素的提取得率呈现出先增加后降低的趋势，液料比值为20时，提取得率最大为1.211%。这是因为随着提取溶剂用量的增加，杨梅素可以充分地溶解，提取得率增加；当液料比值达到20时，杨梅素已基本溶解，此后再增加提取溶剂用量，对提取得率几乎没有影响。因此，适宜的液料比为20 ∶1。

2.1.2乙醇体积分数 准确称取1.0 g杨梅叶粉末5份，置于5个100 mL烧杯中，分别加入60%、 70%、 80%、 90%和100%的乙醇溶液20 mL，摇匀，浸泡0.5 h后，分别加入0.5%表面活性剂，按照2.1.1节方法进行超声波提取，计算杨梅素的提取得率。乙醇体积分数对杨梅素提取得率的影响见图2(b)。由图2(b)可以看出，杨梅素的提取得率随着乙醇体积分数的增加不断增加，当乙醇体积分数为80%时，提取得率达到1.143%，此后体积分数再增加，杨梅素提取得率开始不断下降。根据相似相溶原理，原因是杨梅素与80%的乙醇水溶液的极性接近。因此合适的乙醇体积分数为80%。

2.1.3提取温度 准确称取1.0 g杨梅叶粉末5份，置于5个100 mL烧杯中，加入体积分数80%乙醇溶液20 mL，浸泡后加入0.5%表面活性剂，分别控制提取温度为40、 50、 60、 70和80 ℃，按照2.1.1节实验方法进行超声波提取，并计算杨梅素的提取得率。提取温度对得率的影响结果见图2(c)。由图2(c)可以看出，当温度不断升高时，杨梅素的提取得率呈先增加后降低的趋势，在温度60 ℃时，提取得率最大为1.165%。这是因为温度升高，杨梅素的溶解度增加，故可以提高其提取得率。杨梅素为大分子有机化合物，当温度高于80 ℃时，结构被一定程度地破坏，失去活性；同时高温也会影响表面活性剂的增溶效果，故提取得率会降低。综合分析适宜的提取温度为60 ℃。

2.1.4提取时间 准确称取1.0 g杨梅叶粉末5份，置于5个100 mL烧杯中，按液料比20 ∶1加入体积分数为80%乙醇溶液，浸泡后加入0.5%表面活性剂，分别控制超声波提取时间为20、 30、 40、 50和60 min，按照2.1.1节实验方法进行超声波提取，并计算杨梅素的提取得率。提取时间对杨梅素提取得率的影响结果见图2(d)。由图2(d)可以看出，提取时间达到20～50 min时，杨梅素的提取得率从0.965% 增加到1.273%，提取时间达到60 min时得率又有所下降。这是因为杨梅素溶解于溶剂中需要一段时间，故提取时间的增加为杨梅素提取提供很好的条件，但时间过长可能会导致杨梅素的结构发生变化，影响提取效果。故选择50 min为适宜的提取时间。

2.1.5表面活性剂用量 准确称取1.0 g杨梅叶粉末5份，置于5个100 mL烧杯中，按液料比20 ∶1加入体积分数为80%乙醇溶液，浸泡0.5 h后，加入0.1%、 0.3%、 0.5%、 0.7%和0.9%表面活性剂茶皂素[15]，即0.001、 0.003、 0.005、 0.007和0.009 g，按照2.1.1节实验方法进行超声波提取，并计算杨梅素的提取得率。表面活性剂用量对杨梅素提取得率的影响结果见图2(e)。由图2(e)可以看出，在表面活性剂用量为0.1%～0.9%的范围内，杨梅素的提取得率先增大后减小，用量为0.5%时提取得率最大为1.169%。茶皂素是一类天然提取的表面活性剂，利用分子结构的两亲性可改变提取溶液的界面性质，以此影响杨梅素的提取结果，故表面活性剂对杨梅素有增溶效果[15-16]，提取得率提高。由图可知在表面活性剂用量为0.5%时提取得率最大，故表面活性剂的适宜用量为0.5%。

a.液料比liquid-to-material ratio; b.乙醇体积分数ethanol volume fraction; c.提取温度extraction temperature;

2.2 正交试验优化提取工艺

2.2.1正交试验设计及直观分析 根据单因素试验结果，以液料比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间和表面活性剂用量这5个因素，选取4个不同水平，设计L16(45)正交试验，以此进一步优化杨梅素的最佳提取工艺条件，正交试验设计及直观分析见表1。由表1可以看出，杨梅叶中杨梅素的最佳提取工艺条件为A2B2C3D2E1，即液料比15 ∶1，乙醇体积分数80%，提取温度70 ℃，提取时间为50 min，表面活性剂用量0.3%(0.003 g)，提取得率最高可达到1.35%。

表1 正交试验设计及直观分析Table 1 Orthogonal experimental design and visual analysis

2.2.2正交试验结果的方差分析 对表1结果进行方差分析，结果见表2。方差分析表明，液料比和乙醇体积分数对提取得率的影响较大，提取温度、提取时间和表面活性剂用量对提取得率的影响较小。因此，实际操作过程中，可适当升高温度，减少提取时间或增加表面活性剂用量，以提高生产能力，节约生产成本。

表2 正交试验结果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experimental results

2.2.3验证实验 对2.2.1节的最佳提取工艺条件进行验证实验，操作条件分别为液料比15 ∶1，乙醇体积分数80%，提取温度70 ℃，提取时间为50 min，表面活性剂的用量0.3%。平行3次实验，提取得率取平均值，最终杨梅素提取得率为1.33%。

茶皂素是一类天然表面活性剂，用于杨梅素的提取不会造成二次污染，符合现在的绿色环保理念。本研究采用茶皂素强化提取技术，对比邓丹雯等[17]未加表面活性剂茶皂素提取杨梅素提取时间为1.5 h，提取得率为1.355%，在本实验中加入茶皂素之后提取得率为1.33%，提取时间为50 min,可见加入茶皂素能缩短提取时间，降低提取成本，具有较好的发展前景，可为杨梅素的提取以及杨梅叶的开发提供很好的参考价值。

2.3 杨梅素抗氧化性分析

2.3.1DPPH·清除率 杨梅素对DPPH·的清除率结果见图3(a)。由图3(a)可以看出，在质量浓度0.5～3.0 mg/L的范围内，VC和杨梅素对DPPH·的清除率均不断增加，在低浓度时两者的抗氧化能力均随浓度的升高快速增加，但杨梅素的清除率始终低于VC；当质量浓度达到最高3.0 mg/L时，VC的清除率达到56.49%，此时杨梅素清除率最高为52.11%。其中，杨梅素对DPPH·的IC50值为2.670 mg/L，VC对DPPH·的IC50值为2.363 mg/L。在实验的质量浓度范围内两者的清除效果差别不大，但VC的DPPH·清除效果要略优于杨梅素。

2.3.2·OH清除率 杨梅素对·OH的清除率结果见图3(b)。由图3(b)可知，质量浓度为30～150 mg/L 时，VC对·OH的清除率不断增加，在150 mg/L时达到最高74.96%；而杨梅素对·OH的清除率先增加后保持稳定，当质量浓度为120 mg/L时，杨梅素对·OH的清除率达到最高为64.21%，此时VC的清除率为72.11%。其中，杨梅素对·OH的IC50值为91.139 mg/L，VC对·OH的IC50值为61.483 mg/L。可以看出，杨梅素的·OH清除效果略低于VC。

图3 DPPH· (a)和·OH(b)清除率的测定

3 结 论

3.1以杨梅叶为原料，表面活性剂茶皂素为提取强化剂，采用超声波提取工艺，在单因素试验的基础上，采用正交试验优化杨梅素的提取工艺。结果表明：杨梅素提取的最佳工艺条件为液料比15 ∶1(mL ∶g)，乙醇体积分数80%，提取温度70 ℃，提取时间50 min，表面活性剂茶皂素用量为原料质量的0.3%，在此工艺条件下，杨梅素提取得率可达到1.33%。

3.2杨梅素抗氧化实验结果表明：当质量浓度达到3.0 mg/L时，VC对DPPH·的清除率达到56.49%，杨梅素对DPPH·的清除率为52.11%，VC和杨梅素对DPPH·的IC50值分别为2.363和2.670 mg/L；当质量浓度为150 mg/L 时，VC对·OH的清除率达到最高74.96%，而杨梅素对·OH的清除率在120 mg/L时达到最大，为64.21%，VC和杨梅素对·OH的IC50值分别为61.483和91.139 mg/L。可以看出，杨梅素对DPPH·和·OH清除率较高，抗氧化能力较好，但整体效果略低于VC。