漆酚基BPAU-NH2-Gal紫杉醇载药胶束的pH响应性及其体外性能

齐志文， 周 昊， 陈虹霞， 张昌伟， 邓 涛， 王成章*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042；2.广州中医药大学 热带医学研究所，广东 广州 510405)

抗肿瘤药物紫杉醇水溶性差且生物利用度较低，难以穿透生物屏障到达靶器官或组织[1]，如何将紫杉醇精准地运送到肿瘤部位一直是亟待解决的问题。人体正常组织的pH值为7.4，肿瘤组织由于乳酸的厌氧代谢，pH值为4～5[2]，因此，研究pH敏感型的载药胶束对紫杉醇用于抗肿瘤治疗非常有利。典型的具有pH响应性的载药胶束由两亲分子经自组装形成，粒径为10～200 nm，表面电势绝对值小于50 mV，进一步通过实体瘤的高渗透长滞留效应(EPR)，可以使pH敏感的胶束选择性地富集在肿瘤组织周围[3]。漆酚能够调节DNA的合成[4]，与紫杉醇联用显示出优异的协同抑制肿瘤细胞HepG2增殖活性[5]。同时，漆酚硼酸酯衍生物具有较好的化学稳定性和生物相容性[5]，可以代替传统的十二(四)胺，作为载药胶束的疏水单元[6]。而在硼酸盐分子中引入氮原子可以提高硼酸酯键的水解稳定性[7]。此外，糖基化修饰的胶束易被肿瘤细胞HepG2的糖蛋白受体(ASGPR)识别，并在体内具有更高的生物利用度[8]。本研究通过小分子化学合成及聚合物自组装技术，制备了漆酚基pH响应型胶束BPAU-NH2，以及加入识别单元半乳糖(Gal)的pH响应型胶束BPAU-NH2-Gal，经透析法包埋紫杉醇，表征了其化学结构，并测试了其形貌、粒径、电位等；进一步通过体外载药和释药实验，考察了漆酚基胶束对人体正常肝细胞LO2的毒性，以及人肝癌细胞HepG2对胶束的摄入活性，以期开发一种生物相容性高、稳定性好的漆酚基pH响应型载药胶束，为漆酚基靶向载药胶束材料的开发与应用提供实验数据和理论基础。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

紫杉醇(PTX)，南京源叶生物公司；半乳糖胺(99%)；N，N′-羰基二咪唑(CDI)、氨基官能化甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn为5 000)、5-氨基-1-戊醇、1,3-二氨基戊烷、1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BUDA)，均购于上海阿拉丁试剂公司；香豆素，中国国药控股有限公司；Hoechst 33342染料，德国Hoechst股份有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、人体正常肝细胞LO2及人肝癌细胞HepG2，南京凯基生物有限公司；其他试剂均为分析纯。

7890A高效液相色谱仪，Thermo C18高效液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为V(甲醇) ∶V(水) ∶V(乙腈)=24 ∶39 ∶37，检测波长227 nm，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，进样体积10 μL，透析袋(8 000 u)，美国安捷伦公司；Zeta电位仪，英国马尔文公司；Sigma 703D型表/界面张力仪，瑞典Biolin公司；1515/2414型凝胶色谱(GPC)仪，美国Waters公司；ZS90型激光粒度仪，英国Malvern公司；JEM-2100F型透射电镜，日本Jeol公司；AVANCE II 400 MHz核磁共振波谱仪，德国布鲁克公司。

1.2. 载药胶束材料的自组装

1.2.1合成路径 pH响应型胶束BPAU-NH2的合成路径如图1所示。

图1 pH响应型胶束BPAU-NH2的合成路径

1.2.2BPAU的合成 称取mPEG-NH2(0.08 mmol)，5-氨基-1-戊醇(0.3 mmol)和BUDA(1.2 mmol)溶解于DMSO中，常温反应36 h。随后，加入过量的1，3-二氨基戊烷(1.4 mmol)与体系中过量的BUDA在60 ℃下连续反应24 h，产物冻干得到白色粉末样品，不经处理，直接参与下一步反应。

1.2.3BPAU-NH2的合成 将课题组前期[5]合成的副产物三烯漆酚马来酸酐苯硼酸胺(URU-NH2，0.08 mmol)和BPAU(1.2 mmol)溶解于2 mL DMSO中，60℃条件下搅拌反应24 h。添加1，3-二氨基戊烷(1.4 mmol)消耗过量的BUDA，以20 mL CH2Cl2作稀释剂，60 ℃继续搅拌反应24 h。反应结束后，用去离子水将液体洗涤2次，以除去过量的1，3-二氨基戊烷，有机层用无水MgSO4过夜干燥。除去MgSO4后，冻干得到BPAU-NH2胶束产品。

1.2.4BPAU-NH2-Gal的合成 将半乳糖胺(1.0 mmol)、BPAU-NH2(1.0 mmol)和CDI(1.2 mmol)溶于10 mL乙腈中，回流反应1 h。缓慢滴加三乙胺(TEA)(1.2 mmol)，继续回流反应10 h。反应结束后，大量水洗涤，乙酸乙酯萃取，浓缩蒸干得到胶束粗品。然后将胶束粗品置于透析袋(8 000 u)中，经H2O-H3PO4溶液(体积比100 ∶0.5，2 L)透析，透析液冻干得到BPAU-NH2-Gal胶束产品。

1.3 胶束对紫杉醇的负载和释放

1.3.1 紫杉醇载药胶束的制备 应用透析技术制备紫杉醇载药胶束。将BPAU-NH2-Gal胶束粉末(20.0 mg)和PTX(4.0 mg)溶于3.0 mL pH值7.4的PBS溶液中，室温超声波处理24 h，倒入透析袋(8 000 u)内，用5 L去离子水透析24 h，低温冷冻干燥即可得漆酚基紫杉醇载药胶束PTX@BPAU-NH2-Gal粉末。

1.3.2 胶束对紫杉醇包封率和载药量的测定 采用HPLC测定胶束的载药量和包封率[9]。因紫杉醇难溶于水，未包封的紫杉醇大多会以游离微晶形式存在，滤膜可截留[10]。称取一定质量的PTX@BPAU-NH2-Gal胶束粉末，用纯净水溶解，过0.22 μm滤膜，用甲醇定容，超声波破碎载药胶束，释放胶束包载的全部药物。根据HPLC在227 nm波长处的峰面积，定量计算胶束包埋PTX的总药量。载药量和包封率的计算公式如下：

载药量=载入胶束中紫杉醇的质量/胶束的总质量×100%

包封率=载入胶束中紫杉醇的质量/紫杉醇的总投入量×100%

1.3.3 紫杉醇体外释放机制的考察 按照文献[10]方法，取适量的紫杉醇载药胶束溶液于处理过的透析袋(8 000 u)内。将透析袋置于含0.2%PBS-聚山梨酯80的释放介质中，在室温搅拌(200 r/min)条件下于pH值分别为4.5、 6.8、 7.4的溶液中进行释放实验，分别于1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 24、 34、 44、 65和90 h时，取出微量释放介质经0.22 μm微孔水系滤膜过滤，HPLC法测定PTX含量。

1.4 分析与表征

1.4.1胶束平均相对分子质量的测定 以四氢呋喃(THF)为溶剂，配置1 g/L的胶束溶液备用。采用ShodexOHpack SB-803 HQ凝胶色谱柱，聚苯乙烯(平均重均相对分子质量为2 000)作为标样，THF作为流动相(流速为1 mL/min，25 ℃)，测定胶束的相对分子质量。

1.4.2临界胶束浓度(CMC)测定 用表面张力(γ)-浓度(c)关系作图，当表面吸附达到饱和时，曲线出现转折点，该点的浓度即为临界胶束浓度。通过全自动Biolin表面张力仪的临界胶束浓度(CMC)测量模式，自动测定胶束不同浓度时的表面张力，同时记录γ-c曲线，通过拟合曲线，自动判别拐点并计算出该体系中胶束的CMC值。

1.4.3胶束粒径、Zeta电位的测定 配置1 g/L的胶束去离子水溶液，置于样品池中，采用Zeta电位移测定电位，用激光粒度仪进行粒径分布分析(He-Ne激光，λ为633 nm；散射角为90°)。

1.4.4胶束形貌分析 配置0.1 g/L的胶束去离子水溶液，滴加于铜网上自然风干，透射电镜(电压200 kV，电子束电流为102 μA)下观察胶束形貌。

1.4.5胶束对LO2细胞的毒性 采用噻唑蓝(MTT)法测试载药胶束对LO2细胞的毒性。将对数生长期的细胞按3.5×103个/孔接种于0.2 mL/孔的96孔培养板中，用不同浓度的载药胶束样品孵育72 h。然后，加入10 μL的 5 g/L工作液，继续培养4 h，小心吸去孔内培养液，按150 μL/孔加入DMSO，使结晶充分溶解。用微板阅读器测定波长490 nm处的吸光度(A)。计算细胞存活率(η) ∶η=(1-A实验组/A空白对照组)×100%。

1.4.6胶束对HepG2细胞摄取的荧光强度测试 在pH值为4.5和6.8条件下，分别用包埋少量香豆素(0.01 g/L)的质量浓度为10 g/L的3种载药胶束PTX@BPAU、PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal溶液孵育HepG2细胞，Hoechst 33342(0.01g/L)侵染细胞核，培养2 h。PBS洗涤3次后，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察拍照。香豆素作为检测指标，所有的观察过程均使用相同的曝光时间、亮度和对比度，通过Image-Pro Plus软件分析荧光强度。

2 结果与分析

2.1 胶束的结构表征

采用1H NMR和13C NMR分析聚合物胶束BPAU和BPAU-NH2的结构，结果见图2和图3。

图2 胶束的1H NMR图

BPAU-NH2-Gal：棕色粉末，1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ： 4.45～4.00(Gal-OH),3.25(Gal-NH—)。13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ： 97.63～72.9(Gal-C)。

2.2 载药胶束的性质及形貌分析

胶束GPC测试结果表明：BPAU-NH2-Gal胶束的平均重均相对分子质量(Mw)约为15 550，数均相对分子质量(Mn)约为10 435，分散性指数(PDI)为1.49，表明胶束的聚合物质量分布较为均匀。此外，测得BPAU-NH2-Gal的临界胶束浓度(CMC)值为90.29 mg/L，表明胶束在溶液中的稳定性较好，有利于胶束参与人体循环[3]。BPAU-NH2-Gal的平均粒径及Zeta电位分别为195.5 nm和29.7 mV，其载药胶束PTX@BPAU-NH2-Gal的Zeta电位为30 mV，载药胶束带正电表明胶束容易吸附到带负电的血浆白蛋白上，有利于胶束在血液循环中稳定性的提高和循环时间的延长。此外，胶束表面的亲水羧基可以识别网状内皮系统，有利于胶束实现被动靶向[11]。

同时，由胶束的形貌(图4)可以观察到PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal胶束的微观形貌呈椭圆形不规则结构，颗粒大小较均匀。

PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal的粒径分布如图5所示，其平均粒径大小分别约为135和195 nm，粒径小于200 nm表明两者可通过EPR效应实现肿瘤的被动靶向，并使药物在肿瘤部位积聚；且胶束粒径大于肾清除阈值，可减少肾对胶束的快速清除[12]。PTX@BPAU-NH2-Gal胶束的平均粒径比PTX@BPAU-NH2胶束稍大，可包埋更多紫杉醇。

2.3 胶束安全性及载药和释药性能

胶束对正常细胞LO2的毒性数据见表1，PTX@BPAU-NH2-Gal胶束质量浓度为200 mg/L时，LO2细胞存活率仍大于93%，表明胶束对人正常肝细胞LO2毒性较低，具有较好的生物相容性。此外，HPLC法测得PTX@BPAU-NH2-Gal胶束对紫杉醇的包封率和载药量分别为92.51%和31.76%；PTX@BPAU-NH2胶束对紫杉醇的包封率和载药量分别为90.68%和30.12%。胶束PTX@BPAU-NH2-Gal中存在漆酚侧链脂肪烃，疏水性能较强，导致胶束疏水内核较大，从而提高了胶束的载药量。

表1 胶束对人正常细胞LO2毒性Table 1 Micelles toxicity on human normal cells LO2

图6 载药胶束PTX@BPAU-NH2-Gal的释药性能Fig.6 Drug release performance of drug-loaded micelle PTX@BPAU-NH2-Gal

由图6可知，载药胶束的释药性能呈现pH响应的特性，表现出在低pH值条件下快速释放直至达到平衡释放的特点。胶束pH值较低条件下释药较快的原因，可能是在低pH值下，胺基苯硼酸中酸性修饰基团—COOH发生质子化作用，以及胶束中的叔胺基团在酸性条件下与质子结合形成阳离子基团，引起聚合物链之间的静电排斥效应，使胶束增溶/膨胀，从而达到增大释药量的作用。如图6所示PTX@BPAU-NH2-Gal载药胶束在0.2%PBS-聚山梨酯80体系中，胶束的药物1 h累积释放率在pH值为 7.4 时约为2.35%，而在pH值为4.5时为4.56%；释放8 h时，分别上升到5.8%和19.2%；24 h后，在pH值为7.4时仅为7.9%；在pH值为4.5时为37.64%。显然，酸性条件(pH值为4.5)有助于加快紫杉醇的释放，胶束的药物释放行为表现出强烈的pH依赖性。原因可能是PTX@BPAU-NH2-Gal胶束具有一定的pH响应能力，在酸性介质中发生质子化，导致胶束膨胀，紫杉醇快速释放[13-14]。同时，紫杉醇是一种弱碱性药物，在酸性条件下具有更大的溶解度。因此，紫杉醇在酸性释放介质中扩散更快，导致药物释放更快[15]。

2.4 载药胶束的细胞摄入性能

3种载药胶束PTX@BPAU、PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal对应HepG2细胞的荧光强度见图7。

HepG2细胞荧光强度结果表明：在相同pH值条件下，HepG2细胞对3种载药胶束的摄取具有明显差异。3种胶束与HepG2细胞作用2 h时，在pH值4.5条件下香豆素对应的荧光强度分别为42.57%、65.14%和99.99%；在pH值6.8条件下香豆素对应的荧光强度分别为27.00%、31.06%和51.45%。可以看出，在pH值为4.5时，荧光强度明显高于其在pH值为6.8的环境中，表明HepG2对3种胶束的摄取作用呈pH响应型关系。此外，在相同pH值条件下HepG2细胞对3种载药胶束的摄取具有明显差异，其中HepG2细胞对PTX@BPAU-NH2-Gal载药胶束的摄入能力最强，表明漆酚和半乳糖的引入可以提高HepG2细胞对胶束的摄取[6-7,16]。

3 结 论

3.1在传统pH敏感型胶束BPAU的基础上，以URU-NH2为疏水单元、半乳糖(Gal)为识别单元合成了漆酚基pH响应型胶束BPAU-NH2-Gal，采用多种方法对其结构进行了表征。结果表明：漆酚基pH响应型胶束BPAU-NH2-Gal已经成功合成，证明漆酚硼酸酯分子可以作为疏水单元应用于胶束的制备；其Mw值约为15 550，PDI为1.49，CMC值约为90.29 mg/L，Zeta电位值为29.7 mV。

3.2以紫杉醇(PTX)为受试药物，采用透析法制备了纳米载药胶束PTX@BPAU-NH2-Gal，该载药胶束的外观呈不规则椭圆结构，平均粒径为195 nm左右；对紫杉醇的包封率为92.51%，载药量为31.76%，能够有效运用于紫杉醇的靶向运输。

3.3载药胶束PTX@BPAU-NH2-Gal表现出明显的pH响应性，其药物释放量在pH值4.5时明显高于其在pH值为6.8、7.4的环境；同时表现出对LO2细胞的低毒性，当胶束质量浓度为200 mg/L时，LO2细胞存活率仍大于93%。在pH值4.5条件下，HepG2细胞对该载药胶束具有很强的摄入能力，表明漆酚和半乳糖的引入可以提高HepG2细胞对胶束的摄取。