妊娠合并心脏病孕妇外周血中miR-27a和GATA6水平与妊娠结局关系

赵欣媛，郭婷，丁鹏

(西安医学院第二附属医院a.妇产科,b.心内科，西安 710038)

妊娠合并心脏病孕妇发生不良事件的风险较高，在产科非直接致孕妇死亡原因中排首位，严重威胁孕妇生命健康[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)与心血管系统疾病关系密切。miR-27a属于miR-27家族，在心、肺组织中含量丰富，主要通过调节机体代谢、血管生成、炎症反应、脂肪生成、氧化应激等过程，参与动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病的发生、发展[3-4]。GATA结合蛋白6 (GATA binding protein 6，GATA6)是一种重要的心血管内皮细胞转录因子，可调控心肌细胞转录、心脏循环、房室分隔形成等，对心脏发育过程具有潜在方向性调控作用，其异常表达与先天性心脏病密切相关[5]。目前关于miR-27a、GATA6与妊娠合并心脏病中的研究国内尚未见报道。因此，本研究拟通过检测血清miR-27a、GATA6水平，以期探讨其与妊娠合并心脏病孕妇妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2017年5月至2019年7月西安医学院第二附属医院妇产科收治的妊娠合并心脏病孕妇81例作为病例组，年龄(33.24±3.15)岁，孕周(36.57±2.98)周，身体质量指数(body mass index，BMI)为(24.15±2.21)kg/m2；纳入标准：(1)符合妊娠合并心脏病的诊治专家共识(2016)的诊断标准[6]；(2)均经24 h动态心电图、心脏彩色多普勒超声等检查确诊；(3)均为初产单胎孕妇；(4)不良妊娠结局包括早产、胎儿畸形、羊水异常或死胎等；(5)心功能分级Ⅰ～Ⅳ级；(6)临床资料完整。排除标准：(1)依从性差，不自愿配合调查研究者；(2)并发心律失常或其他恶性肿瘤者；(3)患有精神性疾病、认知功能障碍者。参照心功能分级标准[7]进行分级，其中，先天性心脏病38例(左向右分流型包括房间隔缺损12例，室间隔缺损6例；右向左分流型包括法络四联症8例；无分流型包括主动脉狭窄7例，肺动脉狭窄5例，心功能Ⅰ级9例，Ⅱ级12例，Ⅲ级10例，Ⅳ级7例)，围产期心肌病(扩张型)13例(心功能分级Ⅰ级2例，Ⅱ级4例，Ⅲ级5例，Ⅳ级2例)，妊娠高血压心脏病(患者出现心率加快及心律失常，超声检查出现心脏扩大、射血分数下降，生化检测心肌酶学、B型利钠肽异常升高)30例(心功能分级Ⅰ级5例，Ⅱ级7例，Ⅲ级10例，Ⅳ级8例)。另取同期就诊的妊娠合并心脏病妊娠结局良好者81例为对照组，年龄(32.76±3.29)岁，孕周(36.26±3.29)周， BMI为(24.39±2.16)kg/m2。其中，先天性心脏病46例(左向右分流型包括房间隔缺损16例，室间隔缺损7例；右向左分流型包括法络四联症8例；无分流型包括主动脉狭窄9例，肺动脉狭窄6例。心功能分级Ⅰ级23例，Ⅱ级14例，Ⅲ级7例，Ⅳ级2例)，围产期心肌病(扩张型)35例(心功能分级Ⅰ级17例，Ⅱ级13例，Ⅲ级4例，Ⅳ级1例)。两组妊娠合并心脏病孕妇年龄、孕周、BMI、心脏病类型比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经过西安医学院第二附属医院医学伦理委员会批准(No.2017041-YY)，患者均知情同意。

1.2主要试剂及仪器 miRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)， microRNA定量(qRT-PCR)试剂盒、Perfect Real Time逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)，pro-BNP化学发光检测试剂盒、cTnI化学发光免疫分析法检测试剂盒(南京赛泓瑞生物科技公司)。GENESYS40/50紫外分光光度计(美国Thermo公司)，MODEL550型酶联仪、7500型RT-qPCR仪(美国Bio-Rad公司)，ACCES 型电化学发光仪(美国贝克曼公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 所有孕妇在治疗前于孕周29周时采集空腹外周静脉血3 mL， 1 000×g离心8 min，取上层血清置于EDTA-Na2抗凝的无菌试管中，密封后将试管置于-20 ℃保存。

1.3.2RNA提取及逆转录反应 采用miRNA提取试剂盒提取血清总miRNA，用紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度，取吸光度(A280/260 nm)值为1.8～2.0的样本用于后续试验。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3实时荧光定量PCR检测 引物设计与合成参考文献[8-9]，根据NCBI参考序列中miR-27a与GATA6基因的序列号(NC_000019.10和NM_005257)，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送上海吉玛公司合成。miR-27a上游引物序列：5′-GAACTTAGCCACTGTGAACACCACTTGG-3′，下游引物序列：5′-TTGCTTCCTGTCACAAATCACATTG-3′，产物片段大小182 bp,退火温度60 ℃。GATA6上游引物序列：5′-AGTGCAGACCTGCTGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-ACTTGAGCTCGCAGTTCTCG-3′，产物片段大小592 bp，退火温度64 ℃。RT-qPCR总反应体系为20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 5 s，共40个循环；于65 ℃时采用Bio-Rad CFX manager 软件收集荧光信号。以U6为miR-27a的内参，GADPH为GATA6的内参，采用2-△△Ct法对血清中miR-27a与GATA6mRNA的表达水平进行定量分析，ΔΔCt=(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)。每组设3个复孔。

1.3.4血清相关生化指标检测 采用化学发光法，按照pro-BNP化学发光检测试剂盒、cTnI检测试剂盒及化学发光仪说明书检测。血清cTnI参考范围：0～0.2 g/L，pro-BNP参考范围：0～100 ng/L。

2 结果

2.1病例组与对照组妊娠心脏病孕妇基线资料比较 病例组早产7例，胎儿畸形2例，羊水异常5例，死胎2例。与对照组比较，病例组心功能分级为Ⅰ+Ⅱ级比例显著降低，而Ⅲ+Ⅳ级比例显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 病例组与对照组孕妇一般资料比较

2.2病例组与对照组妊娠心脏病孕妇血清miR-27a、GATA6mRNA水平比较 与对照组血清miR-27a水平(2.17±0.41)、GATA6mRNA水平(0.82±0.16)比较，病例组孕妇血清miR-27a水平(3.35±0.56)升高(t=15.303，P<0.001)，GATA6mRNA水平(0.29±0.04)水平降低(t=28.922，P<0.001)。

2.3病例组与对照组妊娠合并心脏病孕妇血清cTnI、pro-BNP水平比较 与对照组血清cTnI(0.21±0.03)μg/L、pro-BNP(287.15±56.82)ng/L比较，病例组血清cTnI(0.46±0.09)μg/L、pro-BNP的表达水平(946.87±125.41)ng/L均显著升高(t=23.717、43.125，P均<0.001)。

2.4不相同心功能分级患者血清学指标的比较 与心功能分级Ⅰ+Ⅱ级患者比较，Ⅲ+Ⅳ级患者血清中miR-27a、cTnI、pro-BNP表达水平显著升高，GATA6mRNA水平显著降低，差异有统计学意义(P均<0.001)。见表2。

表2 不相同心功能分级患者血清各指标水平的比较

2.5妊娠合并心脏病孕妇血清miR-27a、GATA6mRNA水平与血清生化指标的相关性 Pearson相关性分析结果显示，妊娠合并心脏病孕妇血清miR-27a的表达水平与GATA6mRNA水平呈负相关(r=-0.499，P<0.05)，与血清cTnI、pro-BNP水平均呈正相关(r分别为0.512、0.497，P<0.05)，而GATA6mRNA水平与cTnI、pro-BNP水平均呈负相关(r分别为-0.531、-0.524，P<0.05)。

2.6Logistic回归分析影响妊娠合并心脏病孕妇不良妊娠结局的危险因素 以妊娠合并心脏病患者妊娠结局为因变量，以孕妇年龄、BMI、心功能分级、血清miR-27a、GATA6mRNA、cTnI、pro-BNP水平为自变量，进行Logistic回归分析，结果发现，心功能分级高、血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低是影响妊娠合并心脏病孕妇不良妊娠结局的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 Logistic回归分析影响妊娠合并心脏病孕妇不良妊娠结局的危险因素

3 讨论

妊娠合并心脏病是产科严重并发症之一，若未及时控制可导致孕妇心力衰竭及肺栓塞，甚至死亡，严重影响妊娠结局及胎儿生长发育[10]。研究报道，产前检查可有效降低妊娠合并心脏病患者心力衰竭等不良事件发生情况，改善其妊娠结局[11]。因此寻找妊娠合并心脏病不良妊娠结局相关的敏感生物标志物至关重要。

miR-27a属于基因间区域miRNA，有miR-27a-3p、miR-27a-5p两种异构体，在心、肺组织中表达丰富，在动脉粥样硬化、脑缺血、血管炎症等心血管疾病中发挥重要作用[12]。本研究结果发现，与对照组比较，病例组孕妇血清miR-27a水平显著升高，且与患者血清cTnI、pro-BNP水平呈正相关。房艳红等[13]研究报道，miR-27a在心肌梗死患者外周血中呈显著高表达，其可通过抑制Bcl-2表达促进心肌细胞凋亡，提示妊娠合并心脏病孕妇血清miR-27a升高可能与心肌损伤或心功能障碍有关，进而影响妊娠不良结局发生。

GATA6可增加心脏调控因子的转录水平，在人类心脏分化、发育和功能中发挥重要作用。GATA6基因突变或异常表达与多种先天性心脏病、心律失常、肥厚型心肌病等密切相关[14]。本研究结果发现，与对照组比较，病例组血清GATA6mRNA水平显著增加，提示GATA6mRNA可能与心脏病有关。Yoon等[15]研究报道，GATA6是唯一在多能干细胞分化早期显著诱导的基因，GATA6水平与心肌细胞分化效率呈正相关。岳峰等[5]研究报道，先天性心脏病患儿孕期母亲外周血GATA6mRNA水平显著低于对照组，GATA6mRNA水平升高是胎儿发生先天性心脏病的保护因素。本研究与其他文献报道的结果基本一致，推测GATA6低表达可能降低对动脉导管闭合的促进作用，增加肺动脉畸形、心脏流出道部位心肌细胞的异常增生，与心肌损伤及心室结构异常有关。另外GATA6mRNA水平与miR-27a、cTnI、pro-BNP水平均呈负相关，提示GATA6可能与miR-27a存在拮抗作用，导致妊娠合并心脏病孕妇心脏结构及功能异常，进而诱发不良妊娠结局。本研究进一步分析发现，心功能分级高、血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低是影响妊娠合并心脏病孕妇不良妊娠结局的危险因素。有研究报道，心功能等级越高，发生不良妊娠结局的概率越高[16]，提示血清miR-27a、cTnI、pro-BNP水平升高、GATA6mRNA水平降低可能与心功能等级高有关，预示心脏功能差。血清miR-27a、GATA6mRNA水平有潜力成为妊娠合并心脏病孕妇不良妊娠结局评估的有效参考指标。

综上所述，血清miR-27a水平增加，GATA6mRNA水平降低可能与妊娠合并心脏病孕妇心肌损伤有关，是影响患者不良妊娠结局的危险因素。但本研究也存在不足之处，如研究样本量较少，针对miR-27a与GATA6在妊娠合并心脏病中具体作用机制尚不清楚，有待加大样本量深入探究。