沙棘果油对过氧化氢诱导氧化损伤的保护作用

郑鹏 王波 王前

摘 要：沙棘（Hippophae rhamnoides）是一種具有药用价值的植物，沙棘果油具有抗氧化、抗炎症及抗肿瘤等多种药理作用。为了探讨沙棘果油对H2O2造成氧化性损伤的细胞生长的影响及其抗氧化性，该研究选择H2O2对RAW264.7细胞氧化损伤模型，通过DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除实验检测沙棘果油体外抗氧化能力，用[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐]MTT法和流式细胞仪检测超氧化物阴离子荧光探针（DHE）信号，分别检测不同浓度沙棘果油对H2O2损伤细胞的存活率和超氧化物阴离子水平。结果表明：（1）在DPPH自由基清除实验中，当沙棘果油浓度小于4.9%时，沙棘果油的抗氧化能力大于维生素C。（2）通过MTT法发现，浓度为3.125%的沙棘果油对H2O2损伤细胞的存活率显著升高（P<0.01）。（3）从DHE检测发现，在同一检测时间点，随着沙棘果油浓度增加，DHE阳性细胞比例显著下降（P<0.01）;在不同检测时间点，随着沙棘果油浓度增加，DHE阳性细胞比例显著升高（P<0.01）。沙棘果油对过氧化氢诱导的RAW264.7细胞氧化损伤模型有一定修复作用，可能与细胞内超氧化物阴离子水平受到抑制有关，它具有抗氧化性损伤的潜能。

关键词：沙棘果油，抗氧化性，MTT法，DHE，过氧化氢损伤模型

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）09-1349-08

Abstract：The sea buckthorn fruit （Hippophae rhamnoides） oil is medically claimed as having phytoantioxidant，antiinflammatory， and anticancerous properties in humans. To explore the hydrogen peroxide of the sea buckthorn fruit oil on mouse monocyte macrophages （RAW264.7 cells） oxidative damage model. By spectrophotometry，scavenging effects of sea buckthorn fruit oil on DPPH free radicals; In vitro antioxidant activity was assessed on RAW264.7 cells against hydrogen peroxide （H2O2） induced cytotoxicity. The antioxidant effect was determined by measuring the cell dye MTT[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide] reducing assay. Then the survival rate of RAW264.7 cells was determined by MTT assay，and the expression of superoxide anion was determined by flow cytometry labeling with dihydroethidium（DHE）. The results were as follows：（1）Compared with the antioxidant capacity of vitamin C，when the concentration of sea buckthorn fruit oil was less than 4.9%，the antioxidant capacity of sea buckthorn fruit oil was higher than vitamin C. （2） Comparing to the H2O2 group，3.125% sea buckthorn fruit oil group had higher survival rate（P<0.01）. （3） Comparing to the H2O2 group，the proportion of DHE-positive cell was significantly decreased in the same time （P<0.01） and it was negative effect with concentration of sea buckthorn fruit oil，the proportion of DHE-positive cell was significantly increased at the same concentration（P<0.01），and which was related positive effect with concentration of sea buckthorn fruit oil （P<0.01）. These results support the protective effects of sea buckthorn fruit oil against hydrogen peroxide-induced toxicity in vitro with the underlying mechanisms of inhibiting oxidative stress. Taken together，these results clearly indicate that sea buckthorn fruit oil has significant potential as a natural antioxidant agent，which could be a potential source for the discovery of natrual antioxidant health product.

Key words：

sea buckthorn fruit oil，oxidation resistance，MTT，DHE，hydrogen peroxide damage model

人体在代谢过程中会产生活性氧自由基（ROS），包括超氧阴离子（O-2） 、羟自由基（·OH）、过氧化氢

（H2O2） 和脂质过氧化物的中间产物（Chauhan et al.，1997）。在正常的生理情况下，线粒体需要消耗约2% 的氧产生的ROS，由呼吸链底物端释放出电子还原氧分子单电子，产生ROS的前体

—

O-2和H2O2。在很多疾病以及衰老时，体内氧自由基会产生异常积累。过量的ROS会导致细胞损伤或细胞凋亡。ROS的活泼性和氧化反应能力都很强，能通过氧化作用攻击细胞的生物大分子物质（ 核酸、蛋白质、糖类、脂质） 。当人体处于亚健康状态时，自由基异常累积会引发疾病。近年来，天然抗氧化剂因其安全、高效、能满足亚健康人群日常保健需求的特点而受到广泛关注。

沙棘（Hippophae rhamnoides）是一种具有药用价值的植物，为多年生落叶灌木或小乔木，适应性强，能显著改善生态环境（丁健等，2016）。沙棘果油是从沙棘的果肉中提取的油液，是沙棘的精华，食用安全性高（林黎等，2018）。目前，沙棘对调节血脂（边庆荣等，1999）、促进微循环（吴英等，2000）、抗炎、调节免疫（车锡平等，2000）以及抗癌（李忌等，2008）等方面的研究已有报道。我们前期研究发现，沙棘果油对酒精引起小鼠骨髓细胞微核率和肝脏损伤有一定改善作用（王波，2019）。刘凤云（2005）研究发现，沙棘果油中含有棕榈油酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和不饱和脂肪酸，这些都是人体不能自身合成的脂肪酸，此外还含有维生素C、维生素E和胡萝卜素等多种生物活性物质。魏安琪（2018）研究发现，黄酮类化合物、多酚类化合物、维生素类、多肽类、多糖类物质等均可作为天然抗氧化剂使用。赵二劳等（2017）研究发现，沙棘果油在体外具有抗氧化性，但此研究仅利用DPPH自由基清除实验和Fenton实验在体外检测了沙棘果油的抗氧化活性，而其在体内的抗氧化效果仍不清楚。然而，目前对日常可摄入食品中的天然抗氧化成分含量的研究较少，尤其是在低浓度下的抗氧化能力研究更为缺乏，沙棘果油作为常用的保健品，有必要在细胞水平上对其抗氧化能力进行深入研究。

ROS具有性质活泼和反应性强的特点，既易还原又易氧化，但其本身并不稳定。对其检测的手段有以下几种：电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、气相色谱法、化学发光法、荧光分析法、分光光度法以及电化学方法。但是，这些检测手段能够直接测定的方法却相当有限，因此迫切需要开发直接测定ROS或其他自由基的检测方法（吕惠萍等，2015）。

本研究通过H2O2氧化刺激RAW264.7细胞建立氧化损伤的细胞模型，并对沙棘果油进行干预，先通过细胞存活率等指标的检测，再通过荧光探针（DHE）检测细胞内超氧化物阴离子水平，检测DHE阳性细胞比例，间接反映体内ROS水平，从多角度探讨沙棘果油对氧化损伤的治疗，以期为人们正确认识沙棘果油的保健功能特性以及沙棘果油产品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品和试剂 样品：RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞），由中国科学院上海分院细胞库提供。试剂：细胞培养试剂和消耗材料购于Gibco公司;胰蛋白酶、过氧化氢、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购于国药集团化学试剂有限公司;沙棘果油购于山西五台山沙棘制品有限公司;培养基购于Hyclone公司;96孔板购于Corning公司;超氧化物阴离子荧光探针（dihydroethidium，DHE）购于碧云天生物技术研究所;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 设备 二氧化碳孵育箱（HERE cell150）购于Thermo 公司;酶标仪 （AD340）购于Beckmann公司;流式细胞仪（accurl C6）购于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除实验 以维生素C这个天然的抗氧化剂作为阳性对照，采用DPPH法评估沙棘果油体外的抗氧化活性，为沙棘果油体内抗氧化能力的检测提供浓度依据。

取6%沙棘果油（无水乙醇溶解）为样品，设置维生素C（标准溶液，6%，超纯水溶解）为阳性对照。沙棘果油与维生素C各设置6个浓度梯度，即6%、3%、1.5%、0.75%、0.375%、0.1875%。取96孔板，每个浓度梯度设置8个复孔，每个孔先加入100 μL样品溶液后加入DPPH（0.24%乙醇溶液）。设置空白对照（100 μL样品溶液+100 μL无水乙醇）、阴性对照（100 μL无水乙醇+100 μL DPPH工作液）。避光常温下放置20 min，通過紫外-可见分光光度法测定在517 nm吸光度，取平均值。根据公式计算每个浓度的DPPH清除率，做折线图。

计算公式：清除率（%）=[（1-（A样品-A空白）/A对照）]× 100 %。

1.2.2 RAW264.7细胞培养 将RAW264.7细胞置于含有10%FBS、1%P/S的1640培养基以及在温度37 ℃、5% CO2的培养箱中进行孵育，取对数生长期细胞用培养基调整细胞浓度为1×104个待用。

1.2.3 MTT溶液的配制 用生理盐水溶解1 g的MTT固体，定容，配制成5 mg·mL-1，在无菌环境下过0.22 μm滤膜除菌分装，尽量避光，存放于-4 ℃的冰箱下备用。

1.2.4 H2O2氧化损伤模型建立 将培养基重悬细胞接种于96孔板中（每板细胞数量约1×106个）。每孔加200 μL培养基，摇匀，过夜培养。第二天，吸出每孔废液，通过1.2的DPPH实验可以发现，沙棘果油在浓度5%以下均有较好的抗氧化性。分别加入浓度为5.000%、2.500%、1.250%、0.625%、0.313%、0.156%的H2O2培养基。每组有一个空白对照。24 h后加入每孔200 μL的MTT（5 mg·mL-1）培养基。放置4 h（37 ℃，5% CO2）后每孔加入150 μL DMSO。用摇床摇10 min（37 ℃）后使用酶标仪在490 nm处检测吸光度，得出适于实验的H2O2浓度后使用不会明显影响细胞生长的沙棘果油浓度进行MTT实验。

3 讨论与结论

本研究首次利用H2O2氧化损伤细胞模型检测天然低剂量的沙棘果油的抗氧化性。通过体外DPPH法发现，沙棘果油的浓度在5%以下具有较好的抗氧化性，说明沙棘果油在使用时浓度并非越高越好。通过MTT法我们发现，沙棘果油在一定浓度范围内提高了受氧化损伤细胞的存活率。在细胞水平上进一步验证了沙棘果油具有较好的抗氧化性（曹韦等，2016）。即使在日常摄入量较少的情况下也能够发挥抗氧化功效，有利于进一步阐明常见天然抗氧化剂在人体内的活性机制与药用价值，对于预防自由基诱发的疾病，保护人体健康具有积极意义。

H2O2是一种重要的活性氧，大量存在会造成细胞的氧化应激反应，导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增多（范东艳等，2018）。超氧阴离子自由基（O2-·）是细胞内氧气发生单电子还原反应产生的活性氧自由基（ROS）产物（张雯等，2017）。本研究中，沙棘果油提高了H2O2氧化损伤细胞存活率的结果提示，沙棘果油可能降低了胞内过量O2-·的产生。Dickinson et al.（2011）研究发现，当机体产生过量O2-·后，可以激活细胞的自噬或凋亡信号通路，导致细胞死亡，最终引发多种疾病。DHE是最常用的检测细胞内超氧化物阴离子水平的荧光探针。通过流式细胞仪灵敏地监测O2-·阳性细胞的比例，结果进一步验证了沙棘果油减少了O2-·阳性细胞的数量，这可能是沙棘果油对氧化损伤细胞保护的作用途径之一。实验发现，沙棘果油在使用6 h内效果较好，但随着时间的延长，O2-·阳性细胞的比例有所增加，可见沙棘果油对氧化损伤细胞的保护能力减弱，提示沙棘果油可能需要少量多次使用才能达到较好的效果。这为日常沙棘果油的使用量及使用次数提供了一定的理论指导（张雯等，2017）。除了O2-·以外，沙棘果油是否还参与其他通路抑制氧化应激过程还需要进一步研究。沙棘果油的成分较为复杂，尽管我们知道沙棘果油中含有维生素类，但沙棘果油降低超氧阴离子自由基的功效具体是哪个成分仍需进一步验证。本研究结果为沙棘果油在细胞水平上的抗氧化研究以及进一步开发沙棘果油提供了理论依据。

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（责任编辑 蒋巧媛）