双酶分步酶解红花籽粕制备抗氧化肽

吕凯波*，朱文婷

武汉工商学院环境与生物工程学院（武汉 430065）

红花籽粕是红花籽经过压榨提油后的副产物[1]，无毒、无异味，粗蛋白质含量为20%～60%，且消化率为77%[2]，是物美价廉、营养丰富、氨基酸组成齐全的纯天然植物性蛋白源[3]。目前红花籽粕的主要用途一般作为廉价的肥料和饲料[4]，造成了优质蛋白质资源的极大浪费。研究表明植物蛋白酶解后可获得许多具有多种生物活性的肽，具有清除体内自由基的能力、清除身体内脂质过氧化物、保护红细胞等生理功能[5]。目前已酶解出多种植物性抗氧化肽，如菜籽抗氧化肽[6]、玉米抗氧化肽[7]、大豆抗氧化肽[8]等。对于红花籽粕，国内外学者把主要研究蛋白提取、酶解工艺及氨基酸分析等方面[9-11]。孙立等[12-13]用碱性蛋白酶Alcalase酶解红花籽粕制备红花籽抗氧化肽，通过超滤、凝胶过滤层析对产物进行分离纯化，获得抗氧化活性较强的红花籽多肽，为利用红花籽粕蛋白提供一定参考依据。

此次试验在前期研究基础上发现单酶酶解红花籽粕效果一般[14-16]，故采用双酶分步酶解工艺，以此来提高红花籽粕的水解度和抗氧化性，为制备一种来源广泛、无毒副作用的新型抗氧化剂提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红花籽，新疆产地；木瓜蛋白酶（Papain，2 400 U/mg）、胰蛋白酶（Parenzyme，2 500 U/mg）、中性蛋白酶（Bɑcillus subtilisneutral protease，150 U/mg），购自诺维信公司；三氯化铁、铁氰化钾、30%过氧化氢、硫酸、硼酸、盐酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、氢氧化钠、酚酞、三氯乙酸、甲醛、碱性品红、磷酸二氢钠，郑州莱博仪器设备有限公司；试剂均为分析纯。

UNIVERSAL320高速冷冻离心机，Hettich有限公司；AUY120分析天平，Shimadzu Corpopa Tion Japan；722E可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；ALPHAL-2真空冷冻干燥机，德国M. Christ公司；HH恒温水浴锅，江苏金坛中大仪器厂；PHS-25酸度计，上海雷磁仪器厂；C21-IH02E9电磁炉，浙江苏泊尔股份有限公司；YP202N电子天平，上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 红花籽粕抗氧化肽的制备[17]

采用超声波辅助石油醚提取红花籽油后，低温干燥粉碎后过40目筛即为红花籽粕。红花籽粕经过双酶分步酶解后，迅速沸水浴灭酶10 min，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为红花籽粕抗氧化肽。

1.2.2 红花籽粕酶解试验设计[18]

选中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶组合，每种酶的酶解条件如表1所示[19-23]，组合顺序如表2所示。酶解方法：称取2.5 g红花籽粕，加入50 mL蒸馏水，混匀，调pH，在一定温度下进行第一步酶解（酶解条件及酶组合顺序见表1和表2），酶解后沸水浴10 min灭酶；然后调至一定pH，进行第二步酶解（酶解条件及组合顺序见表1和表2），酶解后，迅速在沸水浴灭酶10 min，以4 000 r/min离心10 min收集上清，进行水解度及还原力的测定。

表1 不同蛋白酶酶解工艺

表2 双酶分步酶解试验设计

1.2.3 水解度的计算

采用凯氏定氮法测定总氮量[24]；采用甲醛滴定法测定酶解液中游离氨基态氮含量[25]。

1.2.4 还原力的测定[13]

将红花籽粕水解液稀释1倍，取1.0 mL于试管中，依次加2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸盐缓冲液、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混合，于50 ℃水浴保温20 min，迅速冷却，然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，摇匀，以3 000 r/min离心10 min。吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，静置10 min，在700 nm处测定吸光度。以吸光度大小来反映酶解液还原力的大小，吸光度越大，表明酶解液的抗氧化性越强。

1.2.5 双酶酶解试验设计

根据1.2.2试验设计测定酶解液水解度和还原力，得到最佳双酶分步酶解顺序。以5%底物浓度，按表3进行双酶酶解正交试验设计。

表3 双酶酶解正交因素水平设计

2 结果与分析

2.1 最佳双酶分步酶解顺序的确定

由表3可知，加酶顺序对酶解效果及产物的还原性影响较大，水解度由大到小依次为5＞3＞2＞6＞1＞4。根据其还原力由大到小依次为3＞2＞5＞4＞6＞1。根据水解度及还原力综合比较，胰蛋白酶与中性蛋白酶、木瓜蛋白酶与中性蛋白酶效果突出。考虑到胰蛋白酶的经济成本比较高，选择3号试验顺序，即第一步采用木瓜蛋白酶酶解，第二步采用中性蛋白酶的双酶分步酶解方法，此时酶解液水解度为66.05%，还原力为0.497。

表4 双酶分步酶解试验结果

2.2 双酶酶解工艺的确定

在底物浓度5%，pH 7.0，酶解温度55 ℃条件下加入木瓜蛋白酶酶解；调整pH为7.2，在酶解温度55℃条件下加入中性蛋白酶酶解，测定酶解液还原力及水解度，结果如表5所示。各因素对水解度影响的主次为D＞B＞A＞C，即中性蛋白酶酶解时间对结果影响最大；各因素对还原力影响的主次为A＞B＞C＞D，即木瓜蛋白酶酶用量对结果影响最大；试验在A2B1C2D3条件下水解度最高，达到84.85%，还原力为0.383；在A1B3C3D3条件下还原力最强，达到0.485，水解度为81.15%。比较2种工艺，酶解液水解度相差不大，但还原力差别较大。综合考虑选择还原力最高工艺条件作为最佳双酶酶解工艺，即木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，木瓜蛋白酶酶解时间1 h，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，中性蛋白酶酶解时间2 h。

表5 双酶酶解正交分析结果表

2.3 双酶分步酶解工艺验证

在木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，pH 7.0，55 ℃酶解1 h后，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，pH 7.2，55℃酶解2 h后，测定酶解液水解度及抗氧化性。结果表明：酶解液的水解度为87.93%±0.86%，还原力为0.489±0.002，此时酶解液具有良好的抗氧化性，可以作为植物源蛋白制备抗氧化肽的一种方法。

3 结果与讨论

以红花籽粕为原料，酶解法制备抗氧化肽时，双酶酶解效果明显优于单酶酶解，加酶顺序对酶解效率及产物还原力影响较大；在双酶分步酶解时，中性蛋白酶酶解时间对水解度影响最大，木瓜蛋白酶酶用量对还原力影响最大；木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，pH 7.0，55 ℃酶解1 h后，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，pH 7.2，55 ℃酶解2 h为最佳双酶酶解工艺；此时水解度可达到87.93%±0.86%，还原力为0.489±0.002，证明酶解液具有良好的抗氧化性。

此次试验利用双酶酶解红花籽粕制备抗氧化活性肽，水解度高，反应条件温和。利用食品级蛋白酶可直接生产安全性高的食用级活性肽[26]，提高了红花籽粕的利用率，为红花籽粕的精深加工开发利用提供思考方向。